人腫瘤壞死因子α轉化酶(TACE)ELISA試劑盒試驗原理
本試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知待測物質濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將待測物質和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中指標的濃度呈比例關系。

試劑盒內容及其配制：
試劑盒成份    96孔配置    48孔配置
96/48人份酶標板    1塊板（96T）    半塊（48T）
塑料膜板蓋    1塊    半塊
標準品    1瓶（1.0ml）    1瓶（0.5ml）
空白對照    1瓶（1.0ml）    1瓶（0.5ml）
標準品稀釋緩沖液    1瓶（8.0ml）    1瓶（4.0ml）
生物素標記抗體    1瓶（8.0ml）    1瓶（4.0ml）
親和鏈酶素-HRP    1瓶（12ml）    1瓶（6.0ml）
洗滌緩沖液    1瓶（20ml）    1瓶（10ml）
底物A    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）
底物B    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）
終止液    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）

自備材料：
1．   蒸餾水。
2．   加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3．   振蕩器及磁力攪拌器等。

樣品收集、處理及保存方法：
1、   血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、   血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、   細胞上清液---1000×g離心10分鐘除顆粒和聚合物。
4、   組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液
5、   保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

操作注意事項：
?       試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。
?       實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。
?       不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
?       使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
?       使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
?       底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
?       加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

安全性：
1．   避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
2．   實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3．   不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

劑盒性能：
1. 靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應。
3. 重復性：板內、板間變異系數均小于10%。

操作步驟：
1．   使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。
2．   根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。
3．   加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。
4．   甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
5．   每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6．   甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
7．   每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。
8．   取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。
9．   在450nm波長處測定各孔的OD值。

結 果 判 斷 與分析：
1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的指標標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度, 再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。