人激肽釋放酶8(KLK 8)ELISA試劑盒僅供科研實驗使用！

本試劑盒采用夾心法酶聯免疫吸附法,用于體外定量分析人血清、血漿、細胞裂解液、細胞培養上清中Kallikrein-8的含量。

檢測原理:
預先包被的抗體和檢測相抗體都是親和純化的Kallikrein-8多克隆抗體。檢測相抗體經生物素標記。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后,PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應;經過PBS或TBS的 洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Kallikrein-8呈正相關。

背景資料:
激肽釋放酶(kallikrein)基因家族是編碼絲氨酸蛋白酶的一組同源基因,串連排列在19q1314染色體上,包括KLK1~KLK15,它們都參與血 管張力與通透性的維持,各種生長因子的裂解和激活,調 節神 經系統可塑性以及皮膚表面細胞脫落與再生等眾多生理過程。

基本參數:
檢測指標:Kallikrein-8;KLK8
檢測范圍:156pg/ml~10000pg/ml
特異性:系統和其它細胞因子無交叉反應
敏感性:<5pg/ml

產品組成:
組分     規格     數量
預包被抗人Kallikrein-8抗體的96孔板     96T     1板
重組人Kallikrein-8標準品(凍干)     10ng/管     2管
生物素標記抗人Kallikrein-8(100X)     100μL     1管
親和素-過氧化物酶復合物(ABC)(100X)     100μL     1管
樣品稀釋液     30mL     1瓶
抗體稀釋液     12mL     1瓶
ABC稀釋液     12mL     1瓶
TMB顯色液     10mL     1瓶
終止液     10mL     1瓶
洗滌緩沖液(25X)     20mL     1瓶
封板膜         4張
保存:2~8℃,有效期6個月。長期不用請置于-20℃可保存1年。

自備器材:
標準規格酶標儀。
自動洗板機。
恒溫箱
系列可調節移液器及吸頭,一次檢測樣品較多時, 用多通道移液器。
干凈的試管和Eppendof管。
用去離子水將25X洗滌緩沖液稀釋25倍,成1X洗滌緩沖液。

注意事項:
使用前TMB顯色液應為無色透明溶液,若發現顏色異常,請及時與我司聯系。
用戶在初次使用試劑盒時,應將各種試劑管離心數分鐘,以便試劑集中到管底。
要嚴格避免操作過程中酶標板干燥。干燥會使酶標板上生物成份迅速失活。
為免交叉污染,要避免重復使用手中的吸頭和試管。
禁止混用不同批次試劑盒內的試劑。
本公司提供的96孔酶標板是單條可拆型酶標板,用戶可按需求使用;剩余的酶標板請按保存條件貯存。
揭封板膜和覆蓋封板膜時應避免用力過大導致液體濺出。

洗板方法:
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將1X洗滌緩沖液至少300μL注入孔內,浸泡1~2分鐘。根據需要,重復此過程數次。
自動洗板:如果有自動洗板機,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

樣品準備:
樣品如果不立即分析,應分裝后冷凍保存,且避免反復凍融。
細胞培養上清:離心去除沉淀,立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
血清:用干凈試管收集血液,室溫凝固30分鐘,離心1000×g 15分鐘,收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
血漿:采用肝素或EDTA抗凝,抽血后30分鐘內離心1000×g 15分鐘。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
貼壁細胞:去除培養液,用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍。加入適量裂解液,用槍吹打數下,使裂解液和細胞充分接觸。通常10秒后,細胞就會被裂解。
懸浮細胞:離心收集細胞,用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍。加入適量裂解液,用槍吹打把細胞吹散,用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后,10000~14000g離心3~5分鐘,取上清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

樣品稀釋:
用戶須估計樣品待測因子的含量,決定適當的稀釋倍數,以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的 檢測范圍。根據待測因子含量高、中、低的不同,分別采取不同的稀釋方案,以下方案僅供參考,樣品的稀釋應有詳細記錄。
高:指待測因子在100~1000ng/ml。一般按1:100稀釋。297μL樣品稀釋液加3μL樣品。
中:指待測因子在10~100ng/ml。一般按1:10稀釋。225μL樣品稀釋液加25μL樣品。
低:指待測因子在156–10,000pg/ml。按1:2稀釋。100μL樣品稀釋液加100μL樣品。
特低:指待測因子≤156pg/ml。樣品一般不做稀釋,或按1:2稀釋。

試劑準備:
KLK8標準品的稀釋和使用:在使用前2小時內準備。試劑盒提供2管標準品,每管10ng,每次使用1管。
配制10,000pg/ml標準品:取1mL樣品稀釋液加入標準品管內,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復顛倒/搓動以助溶解。
配制5000pg/ml~156pg/ml標準品:準備6只Eppendorf管,每管加0.3mL樣品稀釋液,分別標記上5000pg/ml,2500pg/ml,1250pg/ml,625pg/ml,312pg/ml,156pg/ml。取0.3mL 10,000pg/ml的標準品加入標記5000pg/ml的管中,混勻后同樣取出0.3mL,加入下一只管中。余同此類推,直到 一只樣品管。
注意:已經稀釋的標準品(10,000pg/ml),應在12小時內使用。-20℃冷凍保存條件下,2天內可以使用,但不得反復凍融。
生物素標記抗人KLK8抗體工作液的準備:在使用前2小時內準備。
根據每孔需要100μL計算總的用量(實際配制時應多配制100~200μL)。
按1μL生物素標記抗人KLK8加抗體稀釋液99μL的比例配制工作液。輕輕混勻。
親和素-過氧化物酶復合物(ABC)工作液的準備:在使用前1小時內準備。
根據每孔需要100μL計算總的用量(實配時應多配制100~200μL)。
按1μL親和素-過氧化物酶復合物(ABC)加ABC稀釋液99μL的比例配制工作液。輕輕混勻。
注意:已稀釋好的ABC應預先在37℃中平衡至少30分鐘后加入孔內。

操作程序:
已稀釋好的ABC和TMB顯色液在加入酶標板孔前都應預先在37℃中平衡至少30分鐘。試劑或樣品稀釋時,切不可忘記混勻。每次檢測都應該做標準曲線。用戶須估計樣品待測因子的含量,決定適當的稀釋倍數。
確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數目,并增加1孔作為TMB空白顯色孔。總數=樣品數+9;做雙份檢測時×2。其余重包裝好放入冰箱中。
將10,000pg/ml,5000pg/ml,2500pg/ml,1250pg/ml,625pg/ml,312pg/ml,156pg/ml的標準品各100μL依次加入一排7孔中,1孔只加樣品稀釋液的作為零孔。對于人血清、血漿、細胞裂解液、細胞培養上清,直接加已用樣品稀釋液稀釋的樣品100μL。
酶標板加上封板膜,37℃反應90分鐘。
反應后用自動洗板機吸去酶標板內的液體;或甩去酶標板內液體,再對著吸水紙拍幾下。不洗。
將準備好的生物素抗人KLK8抗體工作液按每孔100μL依次加入。(TMB空白顯色孔除外)。
酶標板加上封板膜,37℃反應60分鐘。
1X洗滌緩沖液洗滌3次,每次浸泡1分鐘左右(每孔洗液至少300μL)。
將準備好的ABC工作液按每孔100μL依次加入(TMB空白顯色孔除外)。
酶標板加上封板膜,37℃反應30分鐘。
1X洗滌緩沖液洗滌5次,每次浸泡1~2分鐘左右(每孔洗液至少300μL)。
按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30分鐘的TMB顯色液,37℃避光反應15~20分鐘。
注意:顯色時間供參考,因用戶實驗室條件差異, 顯色時間會有所不同。此時肉眼可見標準品的前3~4孔有明顯的梯度藍色,后3~4孔差別不明顯。
按每孔100μL依次加入終止液,此時藍色立轉黃色。
用酶標儀在450nm測定O.D.值。
有兩種設定空白對照的方案:
① 將TMB空白顯色孔(只加TMB顯色液和終止液)設為對照。所有的標準品和樣品的吸光值減去TMB空白顯色孔的吸光值后,在坐標紙上畫出曲線,以吸光值作為縱坐標,以濃度作為橫坐標。
② 將零孔設為對照。所有的標準品和樣品的吸光值減去零孔的吸光值后,得到的數據可以直接在坐標紙上畫出曲線。
根據樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。用戶也可以使用各種應用軟件來計算。應記住由于樣品稀釋了N倍,其實際濃度應該×N。

操作總結:
加樣品和標準品,37℃反應90分鐘。不洗。
加生物素標記抗體,37℃反應60分鐘。1X洗滌緩沖液洗滌3次。
加ABC,37℃反應30分鐘。1X洗滌緩沖液洗滌5次。
TMB 37℃反應15~20分鐘。
加入終止液,讀數。

參考數據:
取自某些批次質檢數據,僅供參考,用戶需要自己建立標準曲線。
濃度(pg/ml)     0     156     312     625     1250     2500     5000     10000
OD值     0.002     0.115     0.221     0.408     0.692     1.106     1.755     2.485