人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒運用雙抗體夾心ELISA法定量測定人血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養上清液和其他生物液體中人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)含量。

檢測范圍
0.156-10ng/mL此檢測范圍僅供參考,可根據您的要求定做.
最低檢測限 0.067ng/mL

實驗原理
本酶聯免疫吸附測定ELISA試劑盒運用采用雙抗體夾心ELISA法。用抗人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)抗體包被于酶標板上，實驗時樣品或標準品中的人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)與包被抗體結合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素。抗人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)抗體與結合在包被抗體上的人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)結合、生物素與親和素特異性結合而形成免疫復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現藍色，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450nm波長處測OD值，人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣品中人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)的濃度。具體參照各指標試劑盒相應的使用說明書。

試劑盒內容
試劑名稱    數量    試劑名稱    數量
96孔板(預包被)    1    96孔板覆膜    2
標準品    0.5ml×1    標準品稀釋液    1.5ml×1瓶
顯色劑A液    6ml×1瓶    樣品稀釋液    6ml×1瓶
顯色劑B液    6ml×1瓶    終止液    6ml×1瓶
酶標試劑    6ml×1瓶    密封袋    1
濃洗滌液(30×)    1×20mL    使用說明書    1

人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)ELISA試劑盒需自備的設備及試劑
1. 450±10nm濾光片的酶標儀(建議儀器使用前提前預熱)
2. 單道或多道微量加液器及吸頭
3. 稀釋樣品的EP管
4. 蒸餾水或去離子水
5. 吸水紙
6. 盛放洗液的容器

試劑盒的儲存及有效期
1. 未開封的試劑盒：所有試劑均按試劑瓶標簽上所示保存。請注意，收到試劑盒后請盡快將TMB 洗滌液，終止液保存于4℃，其他試劑保存于-20℃。
2. 使用后的試劑盒：剩余試劑仍需按照試劑瓶標簽所示的溫度保存，開封后的酶標板要加干燥劑后密封保存于-20℃，避免潮濕。

注意：
試劑盒內酶標條可拆卸，按實驗需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在首次實驗后 1個月內使用完畢。產品過期時間以盒子上的標簽為準，保質期內所有組分都確保是穩定的。

試劑盒標本的采集與保存
1. 血清：
將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置 2 小時或 4oC 過夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20oC 或-80oC 保存，但應避免反復凍融。
2. 血漿：
用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的 30 分鐘內于 2-8oC 1000×g 離心 15 分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20oC或-80oC 保存，但應避免反復凍融。
3. 組織勻漿：
1） 取適量組織塊，于預冷PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；
2） 可同時選用多種勻漿方法達到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入5-10mL 預冷PBS 進行充分研磨，該過程需在冰上進行（有條件實驗室可選用機器勻漿）；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復凍融 進一步處理（超聲破碎過程中注意冰浴降溫；反復凍融法可重復2次）。
3） 將制備好的勻漿液于5000×g 離心5 分鐘，留取上清即可檢測。
4. 細胞裂解液：
1）貼壁細胞需要先用胰酶消化，離心收集細胞（懸浮細胞可直接離心收集）；
2）將收集到的細胞用冷PBS 洗3 次；
3）物理方法裂解細胞（可先超聲破碎細胞，再反復凍融）：
i 超聲破碎：取適量PBS 重懸細胞，用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂。
ii 反復凍融：將待破碎的細胞在-20 oC 以下冰凍，室溫融解，反復3 次，使細胞溶脹破碎。
4）將標本于2-8 oC 1500×g 離心10 分鐘，收集上清備用。
5. 細胞培養上清或其它生物標本：
請 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20oC 或-80oC 保存，但應避免反復凍融。

注意：
1. 以上標本均需密封保存，4oC保存應小于1周，-20oC不應超過1個月，-80oC不應超過2個月。
2. 標本使用前應緩慢均衡至室溫，不應加熱使之融解。
3. 實驗前紅細胞裂解液必須用標準品稀釋液稀釋。

試劑準備
1. 使用前將所有的試劑和標本緩慢均衡至室溫(18-25oC)，試劑不能直接在37oC溶解。
2. 標準品(凍干品)：每瓶標準品加入標準品稀釋液1mL，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為10ng/mL。準備7個稀釋標準品的EP管，每個EP管中加入150μL的標準品稀釋液，如圖依次倍比稀釋成不同的梯度，10ng/mL-5ng/mL-2.5ng/mL-1.25ng/mL-0.625ng/mL-0.3125ng/mL, 標準品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
3. 濃洗滌液：用580mL蒸餾水或去離子水將20mL濃洗滌液稀釋至600mL，進行30倍稀釋。

標本處理
1. 本公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。
2. 實驗前應預測標本含量，如果標本濃度過高，應對標本進行稀釋，使稀釋后的標本符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。
3. 若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進行預實驗驗證其有效性，并注意留存樣本。