人內(nèi)皮型一氧化氮合成酶3(eNOS-3)ELISA試劑盒本試劑僅供研究使用

試驗原理：
eNOS-3試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知eNOS-3濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將eNOS-3生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中eNOS-3的活性濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制
試劑盒成份（2-8℃保存）    96孔配置    48孔配置    配制
96/48份酶標板    1塊板（96T）    半塊板（48T）    即用型
塑料膜板蓋    1塊    半塊    即用型
標準品：400ng/ml    1瓶（0.6ml）    1瓶（0.3ml）    按說明書進行稀稀
空白對照    1瓶（1.0ml）    1瓶（0.5ml）    即用型
標準品稀釋緩沖液    1瓶（5ml）    1瓶（2.5ml）    即用型
生物素標記的eNOS-3抗體    1瓶（6ml）    1瓶（3.0ml）    即用型
親和鏈酶素-HRP    1瓶（10ml）    1瓶（5.0ml）    即用型
洗滌緩沖液    1瓶（20ml）    1瓶（10ml）    按說明書進行稀釋
底物A    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）    即用型
底物B    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）    即用型
終止液    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）    即用型

自備材料
1．蒸餾水。
2．加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3．振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性
1．避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
2．實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

人內(nèi)皮型一氧化氮合成酶3(eNOS-3)ELISA試劑盒操作注意事項
1．試劑應(yīng)按標簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟棄，不可保存。
2．實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
3．不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4．使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6．洗滌酶標板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應(yīng)孔中吸水。
7．底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8．加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
9．按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

人內(nèi)皮型一氧化氮合成酶3(eNOS-3)ELISA試劑盒樣品收集、處理及保存方法
1、血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4、保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備
1．標準品：標準品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
400ng/ml    （6號標準品）    原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
200ng/ml    （5號標準品）    100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
100ng/ml    （4號標準品）    100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
50ng/ml    （3號標準品）    100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
25ng/ml    （2號標準品）    100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
12.5ng/ml    （1號標準品）    100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0ng/ml    （空白對照）    原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2．洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

人內(nèi)皮型一氧化氮合成酶3(eNOS-3)ELISA試劑盒操作步驟
1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3．加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8．取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9．在450nm波長處測定各孔的OD值。

性能
1.靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2.特異性：不與人其它細胞因子反應(yīng)。
3.重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
4.局限性：6號標準品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標準曲線無法得到精確的結(jié)果。

結(jié)果判斷與分析
1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應(yīng)的eNOS-3標準品濃度為橫坐標（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的eNOS-3含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度。
3、檢測值范圍：0-400ng/ml
4、敏感度：1.0ng/ml