人黃體生成素釋放激素(LHRH)ELISA試劑盒
本試劑僅供研究使用
 
實驗原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被黃體生成素受體（LHR）抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的黃體生成素受體（LHR）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
 
試劑盒組成
 

名稱	96孔配置	48孔配置	備注
微孔酶標板	12孔×8條	12孔×4條	無
標準品	0.3mL*6管	0.3mL*6管	無
樣本稀釋液	6mL	3mL	無
檢測抗體-HRP	10mL	5mL	無
20×洗滌緩沖液	25mL	15mL	按說明書進行稀釋
底物A	6mL	3mL	無
底物B	6mL	3mL	無
終止液	6mL	3mL	無
封板膜	2張	2張	無
說明書	1份	1份	無
自封袋	1個	1個	無

注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0、150、300、600、1200、2400 pg/mL
自備材料
1．蒸餾水。
2．加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3．振蕩器及磁力攪拌器等。
 
安全性
1．避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
2．實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
 
操作注意事項
1．試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。
2．實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。
3．不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
4．使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6．洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7．底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
8．加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9．按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
 
樣品收集、處理及保存方法
1、血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4、保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
 
試劑的準備
1．標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
400ng/ml（6號標準品）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
200ng/ml（5號標準品）100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
100ng/ml（4號標準品）100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
50ng/ml（3號標準品）100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
25ng/ml（2號標準品）100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
12.5ng/ml（1號標準品）100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0ng/ml（空白對照）原始濃度不用稀釋直接加入50ul。
2．洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。
 
操作步驟
1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。
2．根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。
3．加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生wu素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4．甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6．甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8．取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。
9．在450nm波長處測定各孔的OD值。
 
性能
1.靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
2.特異性：不與人其它細胞因子反應。
3.重復性：板內、板間變異系數均小于10%。
4.局限性：6號標準品以上的結果為非線性的，根據此標準曲線無法得到精確的結果。
 
結果判斷與分析
1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的Orexin A標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的Orexin A含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。
3、檢測值范圍：0-400ng/ml
4、敏感度：1.0ng/ml