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![雙[三(羥甲基)氨基甲烷],CAS:6976-37-0](http://struc.chem960.com/strucimg/7000/ctzw0nzi34oyob9fnlmhiwee.png)
PCR技術(shù)可用于：（1）檢驗(yàn)感染性疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)；（2）有效檢測(cè)癌基因的突變，準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因的表達(dá)量
PCR技術(shù)
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 |
PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。
PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：
①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備； ②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；
③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。
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| 實(shí)驗(yàn)材料 |
模板DNA
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| 試劑、試劑盒 |
dNTP Taq DNA聚合酶 蒸餾水 PCR緩沖液 引物 氯化鎂
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| 儀器、耗材 |
PCR儀 移液槍 PCR板 薄壁管 離心管 離心管盒
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| 實(shí)驗(yàn)步驟 |
展開
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| 注意事項(xiàng) | |
| 其他 | 一、 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié) 1. 模板核酸的制備。 2. 引物的質(zhì)量與特異性。 3. 酶的質(zhì)量。 4. PCR循環(huán)條件。 二、 PCR常見問(wèn)題及對(duì)策 1. 假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
（1）模板原因
① 模板中含有雜蛋白質(zhì)。 ② 模板中含有Taq酶抑制劑。 ③ 模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白。 ④ 在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。 ⑤ 模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。 （2）酶失活
① 需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。 ② 忘加Taq酶或溴乙錠。 （3）引物
① 引物質(zhì)量。 ② 引物的濃度。 ③ 兩條引物的濃度是否對(duì)稱。 解決對(duì)策： ① 選定一個(gè)好的引物合成單 位。 ② 引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條 帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。 ③ 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。 ④ 引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。 （4）Mg2+濃度
① 濃度過(guò)高降低PCR擴(kuò)增的特異性。 ② 濃度過(guò)低影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。 （5）反應(yīng)體積的改變
① 通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定; ② 在做小體積如20 ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。 （6）物理原因
① 變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性。 ② 退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率；退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。 ③ 擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度有問(wèn)題。 （7）靶序列變異
① 靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合。 ② 靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列。 2. 假陽(yáng)性，出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。
（1）引物設(shè)計(jì)不合適
① 選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性。 ② 靶序列太短或引物太短。 （2）靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染
① 整個(gè)基因組或大片段的交叉污染。 解決方案：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 ② 空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生。 解決方案：可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。 3. 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。
（1） 引物與靶序列不完全互補(bǔ)或引物聚合形成二聚體。 （2） Mg2+離子濃度過(guò)高。 （3） 退火溫度過(guò)低。 （4） PCR循環(huán)次數(shù) 過(guò)多有關(guān)。
（5） 酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。 其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。 4. 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
（1）原因
① 酶量過(guò)多。 ② 酶的質(zhì)量差。 ③ dNTP濃度過(guò)高。 ④ Mg2+濃度過(guò)高。
⑤ 退火溫度過(guò)低。 ⑥ 循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。 （2）對(duì)策 ① 減少酶量。 ② 調(diào)換另一來(lái)源的酶。 ③ 減少dNTP的濃度。 ④ 適當(dāng)降低Mg2+濃度。 ⑤ 增加模板量。 ⑥ 減少循環(huán)次數(shù)。 |