這里說的穩轉細胞系的構建是指慢病毒轉染構建的穩轉細胞系，可以構建表達細胞系，也能構建敲降細胞系，經常有人問我什么叫穩轉和順轉的區別。瞬轉細胞系，一般情況下能夠穩定表達zui多長一周左右，而穩轉細胞系，只要構建成功就能穩定表達，沒有時間限制，但是也不是肯定的，一般實驗構建的細胞系超過 10 代以后，這個細胞系就有可能不靠譜了。

接下來，咱們講講穩轉細胞系的構建。

一般來講 shRNA 用的是 HIV 病毒，雖然已經經過處理，但是一聽這名字也覺得滲人，無論如何保護自己是在實驗室永葆青春的基礎，所以一定要保護好自己，需要生物安全柜（往里吹風zui好），或者超凈臺（把風給關了 （*^__^*））。（下圖是慢病毒構建載體示意圖）

病毒來了，需要分裝，-80 保存，反復凍融影響病毒活性，一般情況系，我是將病毒分成 10 ul 一管。其次是看清你自己的病毒情況，是熒光標記（一般 GFP），還是非熒光標記 （一般標簽蛋白是過表達是 Flag，敲降是 scramble）。

元元做的是腫瘤相關實驗，所以咱們這里講的是貼壁的腫瘤細胞的穩轉，一定注意，元元講的是普適的方法，一定要看廠家的說明書。一般先用帶有 GFP 熒光的病毒摸一下合適的病毒量。先做一下預實驗，（別人都講 MOI 值，即感染時病毒與細胞數量的比值），元元不講。

1. 慢病毒轉染前 18～24 小時，將貼壁細胞 以 1×10^5（根據細胞大小而定，一般轉染前細胞長到 40-60% 為宜）孔鋪到 24 孔板中。使細胞在慢病毒轉染時的數量為 2×10^5/孔左右。

2. 加入 polybrene6-8 ug/ml（這個相當是破膜劑，只有細胞膜破了，病毒才有機會進入細胞內發揮作用），設置合適的病毒濃度梯度，比如 24 孔板，設置 5 個梯度，分別加入病毒量是 0，1，2，3，4，5 ul，37 ℃ 孵育。這時候用的是無血清的培養基培養。

3. 4～6 h 換液 （正常的含血清的新鮮培養基），繼續培養，如果慢病毒含有熒光蛋白，一般轉染 48 小時后可見明顯熒光表達，72 小時后更加明顯。用熒光顯微鏡觀察細胞的轉染效率，一般病毒量達到一定程度之后就熒光強度就不再增加了。

4. 選擇一個合適的病毒量就可以做實驗了，如果 3ul 的時候病毒的轉染效率已經和后面的沒有區別了，在 24 孔板里，合適的病毒量就是 3ul。這時候就可以構建的穩轉細胞系了。

5. 當你把實驗組對照組轉完病毒后 24 h 就可以進行嘌呤篩選，因為病毒轉完之后轉染效率不可能達到 100%，而慢病毒在構建的時候就含有嘌呤抗性基因，一旦轉入細胞，嘌呤抗性基因就能表達嘌呤抗性蛋白，可以抵抗嘌呤對細胞的殺傷作用。有人問了，嘌呤濃度怎么定

（一句話摸濃度，在 24 孔板里，設置不同濃度梯度，48 h 細胞全部殺死的濃度即為你要的嘌呤濃度），一般在 1 ug/ml 左右，所以設定濃度一般在 0～4 ug/ml。

常見問題解答

1. 元元，我病毒轉染效率不高怎么辦？

答：zui簡單粗暴的方法是加大病毒量，不好使，那么就得從步驟入手了*：4～6 h 換液的時間延長，8～10 h，設置過夜試試。還有一種是 4～6 小時換液的時候用的等量的有血清新鮮培養基稀釋原有的無血清的培養基，不撤掉病毒，繼續培養 24 小時，用新鮮培養基替換含有病毒的培養基。

2. 元元，我著急做實驗，我不用 24 孔板，行不行，我用瓶，用平皿行不行？

答：如果你病毒量足夠的話，完全可以。那怎么換算呢，根據細胞量或者培養基以及底面積自己算個大概的病毒量就行。

自己換算吧，元元數學不好。

3. 元元，還有個問題是不是擴增倍數越多越好？

答：這個不是的，HIV 病毒是逆轉錄病毒，會隨機插入基因組，擴增倍數越大，說明插入基因組的數量越多，這樣基因被損壞的越多，一般文章非編碼 6～8 倍左右，編碼基因 2～4 倍即可，太多了不好。

4.元元，還有個問題......

答：今天打烊了。