本公司專業(yè)經(jīng)銷代理進口試劑，近日，我司實驗室經(jīng)常接到客戶這樣的疑問，他們在測試大腸桿菌轉(zhuǎn)化子時，大腸桿菌轉(zhuǎn)化子有大有小，結(jié)果詭異，想咨詢一下具體原因。

     這情況我遇到過，尤其菌液PCR時候，有的強有的弱，有的帶大小還不一樣。我沒有具體研究過啥愿意，但把大小一樣的那個送去測序，一般都是正確的。

關(guān)于你的這個情況，我分析【我自己的我也分析過】
1、可能酶產(chǎn)物碎了一些，這樣連進去就有大有小。如果你引物用的是在載體上的，那很可能擴出大小不同的。如果你引物就是在基因上的，這個好解決，你把退火溫度逐漸提高，看看是不是那個不同片段就沒了。
2、有的時候發(fā)生了片段自連【這個看起來好像很可笑，但其實我發(fā)現(xiàn)只要末端有一個堿基配對，時間長的話，片段是可以連接到一起的，這個就跟TA連接實際一樣】。
3、你的電泳系統(tǒng)有污染，你把別人的片段給收進去了，這個我確實證實過，我一批克隆40個基因，我曾經(jīng)在別的克隆中挑出過另外的基因。
4、另一種可能，你T載體上連接的方向問題，如果酶切不徹底，可能同樣會造成不同大小片段，這些如果你量很多的話其實在跑電泳回收時候是分不開的，但PCR趕巧了，也許就正好擴出來了【這種情況只限于載體上有你用的酶切位點，而你目的片段上恰恰引入了這連個酶，這個你可以試著畫個圖看看，把TA連接的正反畫畫】。
5、DH好像能長很大的，也沒關(guān)系的，我的有時候就很大點，其實不用放室溫，你冰箱4-8℃那層放置1個月，就看出來了。
6、所以我覺得這個問題也沒法糾結(jié)了。如果你覺得切割實在很難，那干脆重新PCR從T載體上擴出來【高保真擴一般也不會突變，當然TAKARA的primerstar除外】，帶上酶切位點，然后直接回收酶切連接就可以了，找到重組子后測序正確在表達就行了不是。