免疫熒光染色是一種常用的一種生物化學檢查方法，常用于組織學中抗原或抗體的定位，也可用于體液標本中抗原或抗體的定量檢測。許多小伙伴，在做免疫熒光染色實驗時，碰到各種各樣的問題。事實上，掌握了免疫熒光染色實驗的原理、操作步驟及注意事項，要成功完成一項免疫熒光染色實驗并不難。

1、免疫熒光技術是什么?


免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術，主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結合來顯示目的蛋白。免疫熒光技術既有抗原抗體反應的高度特異性，又能在熒光顯微鏡下清晰地顯示其形態，直觀性強。


免疫熒光染色實驗有兩種，包括直接免疫熒光法和間接免疫熒光法。




免疫熒光法原理圖


直接免疫熒光法是最早的方法。其基本原理是用已知的抗體標記上熒光素后成為特異性熒光抗體，染色時將該抗體直接滴在載玻片上進行孵育，使之直接與載玻片上的抗原結合，在熒光顯微鏡下直接觀察，作出判斷。


間接免疫熒光法的基本原理是用特異性的抗體與切片中的抗原結合后，繼用間接熒光抗體，與前面的抗原抗體復合物結合，形成抗原抗體熒光復合物。在熒光顯微鏡下，根據復合物的發光情況來確定所檢測的抗原。


兩種方法，基本原理是一樣的。免疫熒光 (IF) 或細胞成像技術使用抗體將熒光染料（也稱為熒光素或熒光物）標記到特異性目標抗原上，所用熒光染料有諸如異硫氰酸熒光素 (FITC) 等。而通過化學方法偶聯熒光素的抗體被廣泛使用于IF實驗中。


直接免疫熒光法簡單易行、特異性高、快速方便，常用于腎活檢組織幾種免疫球蛋白的檢測和病原體的檢測。但其不足是只能檢測相應的一種物質，敏感性較差，效果有時不理想。


間接免疫熒光法由于結合在抗原抗體復合物上的熒光素抗體增多，發出的熒光亮度強，因而其敏感性強。所以間接免疫熒光法更加常用，只需制備一種種屬熒光抗體，即可適用于多種第一抗體的標記顯示。


2、免疫熒光染色實驗操作步驟


免疫熒光染色的操作方案通常包括：固定和透化、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、再次洗滌以及測定讀數。本文以間接免疫熒光法為例，講講從固定到封片每個步驟的原理。


1）樣品準備(Sample preparation)


對于貼壁細胞：可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培養細胞，然后到預定時間時進行固定等后續操作。也可以用潔凈的蓋玻片，70%乙醇中浸泡后，用無菌的鑷子放置到6孔板內，然后用無菌的生理鹽水、PBS或培養液洗去殘留的乙醇。這時就可以種入細胞進行培養，待細胞貼在蓋玻片上生長良好后，即可進行固定等后續操作。


對于懸浮細胞：把細胞先在固定液中固定，然后把細胞滴加在載玻片上，干燥后細胞會緊貼在載玻片上。然后就可以進行后續操作。如果細胞的粘附能力不佳，可以在載玻片上用PDL等物質進行處理，以增強載玻片的粘附能力。


對于冷凍切片：切片放置在載玻片上后，可以直接進行固定等后續操作。


對于石蠟切片：切片在二甲苯中脫蠟5分鐘，再換用新鮮的二甲苯脫蠟，共用二甲苯脫蠟3次。無水乙醇5分鐘，兩次。90%乙醇5分鐘，兩次，70％乙醇5分鐘，一次。蒸餾水5分鐘，兩次。


抗原修復：根據不同的抗原和抗體，可以選擇把切片放置在如下抗原修復液中，10mM檸檬酸鈉，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris, pH10.0，95℃加熱12分鐘，大約在30分鐘內緩慢冷卻至室溫。


2）固定


目的是保留組織的原始結構，維持細胞形態和抗原的細胞分布。當組織細胞死亡時，細胞發生分解，從其溶酶體和其他細胞器中釋放的酶，可以水解組織，這一過程稱為自溶。為了避免這種情況，固定組織細胞很有必要。


可以使用適當的固定液固定細胞或切片，固定完畢后，可以用免疫染色洗滌液(P0106)洗滌兩次，每次5分鐘。常用的固定劑有甲醛，戊二醛，甲醇/丙酮。不同固定劑所需時間和濃度不一，需要根據具體實驗進行探索。


3）破膜


破膜是為了讓抗體能與抗原有機會相見。因為免疫染色的基本原理就是讓抗原抗體相結合，然后標記的抗體通過發熒光，使得我們可以對目的蛋白進行定性或定量分析。如果要檢測的抗原在細胞膜外表面或細胞外基質，那么可以省去破膜步驟。因為在不破膜的情況下，抗體也能有機會與抗原結合。但是，如果需要檢測的抗原在細胞內，則需要破膜，將細胞暴露于針對目的蛋白的第一抗體，以確?？贵w可進入表位。常用的破膜劑有Triton X-100, NP-40, Brij-58, 皂苷, 洋地黃皂苷, 甲醇/丙酮。同樣，應根據具體實驗進行破膜劑的選擇。


4）封閉(Blocking)


封閉是使一抗的非特異性結合最小化的重要步驟。在使用特異性的一抗與目的蛋白結合的過程中，如果有非特異性結合，則可能出現假陽性結果，較強的背景染色也會干擾目的染色的呈現，影響實驗結果的判斷。從理論上講，任何不結合靶抗原的蛋白質都可以用于封閉。血清是一種常見的封閉劑，因為它含有與非特異性位點結合的抗體。用血清或蛋白質封閉劑封閉可防止抗體與組織或Fc受體非特異性結合。


從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產生較高的背景。


5）一抗孵育(Primary antibody incubation)


事先選擇的特異性一抗可以與目的蛋白結合。這一步需要注意的是一抗是抗什么物種的。如果組織細胞來源是小鼠，則一抗應該是某種動物抗小鼠，這里的某種動物是指一抗宿主，比如，一抗是羊抗小鼠，羊便是一抗宿主。


6）二抗孵育(Secondary antibody inucubation)


第一抗體孵育后，洗掉未結合的一抗抗體，便可以進行一抗與二抗的結合。二抗應該是針對第一抗體宿主物種的，熒光標記的第二抗體。例如，一抗是羊抗小鼠，二抗應該是某種動物抗羊，比如兔抗羊。


如果進行的是雙染，就要注意一抗二抗宿主的選擇，不要使其有交叉結合的可能。比如，組織來源是小鼠，有兩個目的蛋白需要檢測，一抗宿主應該要不一樣，二抗應有不同熒光標記。針對A目的蛋白的一抗是羊抗小鼠，針對B目的蛋白的一抗可以是大鼠抗小鼠（大鼠和羊是不同一抗宿主），A二抗是帶有綠色熒光的兔抗羊二抗，B二抗是帶有紅色熒光的兔抗大鼠二抗，這種搭配是可以的。在熒光顯微鏡下，A目的蛋白染成了綠色，B目的蛋白則染成了紅色。但是，如果B一抗也是羊抗小鼠，則A二抗也會與B一抗結合，這時候就亂了，熒光鏡下一片綠。


7）封片


封片是指免疫染色后，使用固定介質將蓋玻片粘附到組織切片或細胞涂片上。封片可以保護已染色的標本，以免受到物理損害。進行封片的固定介質也有助于提高顯微鏡下圖像的清晰度和對比度。


8）蛋白檢測(Detection of proteins)


對于免疫熒光染色，此時已經可以直接到熒光顯微鏡下觀察。





3、三種細胞免疫熒光染色實驗操作舉例


zo-1的免疫熒光


1）細胞在蓋片上生長融合到95%-100%時，從孵箱中取出。


2） 用預溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘


3）4%的甲醛室溫固定20-30分鐘


4）1×PBS洗3次，每次10分鐘


5） 0.2%Triton X-100透化2-5分鐘


6）1×PBS洗3次，每次10分鐘


7. 5%BSA室溫封閉30分鐘


8） 加一抗(用1%BSA稀釋)放在濕盒里，4度過夜


9）1×PBS洗3次，每次10分


10）加二抗（用1%BSA稀釋）30分鐘，閉光！!！


11）1×PBS洗3次，每次10分鐘


12） 95%甘油封片


注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋"


細胞爬片的免疫熒光


1）取出細胞爬片放到35mm或60mm用過的培養皿里，PBS洗三遍。


有的時候作的細胞爬片可能比較小，夾取的時候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時候加PBS不要太沖，不要細胞沖下來。洗的時候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘。


2） 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。


3）0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍。


4） 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。


5）一抗4度濕盒內過夜，也可37度2小時，感覺前者效果好，PBS洗三遍。


6）二抗室溫2小時(避光)，或者37度1半小時，PBS洗三遍。


7）最好用DAPI染核，然后直接照熒光片。


8）蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因為甘油不象樹脂那樣會干，所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊涂。


細胞免疫熒光簡單實驗


1）漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小時.


2）-20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘


3）PBS洗凈:3min*3


4）1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS


5）PBS洗凈:2*5min


6）羊血清封閉：37度，20分鐘


7）一抗，4度過夜，一般要大于18小時或者37度1-2小時


8） 4度PBS洗凈，3min*5次


9）二抗37度小于一小時


10） 37度PBS洗凈，3*5min涼干封片(封閉液PH8.5)


不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間，如果結果背景較高可以延長漂洗的次數和時間。





4、免疫熒光染色操作注意事項


1）熒光試劑要放好


盡管許多熒光基團具有相對的光穩定性，但在保存和染色過程中若未能避光，則可能導致熒光基團-抗體結合物降解，引起假陰性結果。因此，熒光物質必須在建議溫度下小心保存，并始終注意避光，以保護其光譜完整性。


2）選擇熒光要謹慎


免疫熒光技術的一個主要優勢在于它為多重檢測提供了機會，如今流式細胞儀能檢測每個細胞中20多個離散參數。在設計多重實驗時，應考慮每種熒光基團的獨特性質，如最大吸收波長和最大發射波長，消光系數和斯托克斯位移等因素。


3）合適對照不可少


任何實驗數據的分析都依賴于相關的對照，免疫熒光染色也不例外。每次試驗時 ，需設置以下三種對照：


（1） 陽性對照：陽性血清+熒光標記物


（2） 陰性對照：陰性血清+熒光標記物


（3） 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物


5、免疫熒光實驗常見問題排除指南


1）背景染色太強


背景染色太強是指除了我們想看到的特異性染色在前臺唱主角演戲，還有一堆吃瓜群眾（與想看到的特異性染色顏色相同）在后面搶戲。


是什么原因導致這些戲精搶了主角的戲呢？可能的原因如下。


組織切片太厚：這種情況下可以選擇將組織切片變薄試試。


封閉不佳:封閉的目的就是為了減少非特異性的結合，減少背景染色。如果背景太強，可以考慮換種封閉液或者增加封閉孵育的時間


二抗有非特異性結合：要想驗證是否如此，可以在染色過程中做個只加二抗的空白對照（也就是說不用特異性的一抗進行一抗的孵育過程，比如用一抗稀釋液進行孵育一抗的步驟）. 如果空白對照有染色，說明二抗有非特異性結合，這時候建議更換一種二抗。


自體熒光:想知道組織是否有自體熒光，查看在非染色區域是否有熒光即可。有些自體熒光來自固定步驟，可以避免使用戊二醛固定，或者使用含0.1% 氫硼化鈉的PBS洗滌以除去游離的醛基。還有些熒光來自內源性的熒光分子，可以用蘇丹黑/硫酸銅進行光漂白。


抗體濃度太高：降低所使用的抗體濃度或調整孵育時間。


洗滌不充分:染色有很多步驟，其中又包括很多洗滌的步驟。在實驗過程中，確保洗滌到位，不要偷工減料。


2）染色較弱或沒有染色


可能的原因如下：組織本身不存在你想研究的目的蛋白或者表達量很少。


如果懷疑目的蛋白并不存在，可以通過多種方式驗證，比如WB。因為不同探究蛋白的實驗的原理和操作會不一樣，所以可能得到的結果會不一樣，多種實驗的驗證更有可能避免假陰性的出現。如果目的蛋白表達量很少，則可以考慮增加一個擴大熒光信號的步驟。


熒光顯微鏡的問題。


如果對熒光顯微鏡的參數設置不對，有可能導致看不到熒光。比如光源/濾光設備與你想檢測的熒光不匹配。每次拍照，記得檢查參數是否有誤。


曝光時間太短或吸光太少（gain值太低）:可以嘗試調大Gain值并/或增加曝光時間，找到最佳值。


曝光時間太長，出現熒光淬滅：避免讓切片過度曝光。使用完立即將切片保存在黑暗處。


細胞/組織固定過度：因為過度固定可以讓抗原表位帶上面具，使得抗體無法與抗原結合，這樣當然就沒啥熒光啦。所以可以嘗試減少固定的時間，也可以嘗試做抗原修復以顯現抗原表位。


組織/細胞干透:確保整個染色過程中，切片都處于潮濕環境。


細胞沒有通透，一抗進不去:舉例來說，如果你想研究的目的蛋白在細胞里面，但是抗體因為沒有金剛鉆，不能進入細胞里與目的蛋白長相廝守，那么你當然看不到它們的愛情閃光點。所以呢，可以想辦法讓細胞開通綠色通道，搭個鵲橋。比如，如果使用甲醛固定組織細胞，可以用0.2% Triton X-100（不同實驗可能所需濃度不一）通透細胞。如果是用甲醇或者丙酮固定的組織細胞，則不需要使用Triton X-100，因為前者可以通透細胞。


一抗量不夠/孵育時間太短:提高抗體的濃度或增加孵育時間


一抗不合適：購買一抗前，記得閱讀產品信息，不是所有一抗都可以進行免疫熒光染色實驗的。另外，確保產品沒有過期。


一抗二抗不兼容：舉例來說，如果你的組織來源是小鼠，那么一抗應該是某種動物抗小鼠，比如山羊抗小鼠，那么，此時二抗應該是某種動物抗山羊，比如兔抗山羊。也就是說，二抗應該是抗一抗宿主的。


切片儲存時間過長：樣品染色后應該盡快觀察拍照，否則信號會隨時間減弱。可以考慮將切片保存在 4?C 避光處，盡量延長儲存時間。


抗體儲存問題：避免反復凍融抗體，因為可能會引起抗體出現降解。建議買了抗體后，根據實驗每次的需求，將抗體分成多個小份保存，這樣每次使用一個小管即可。另外，儲存前記得看說明書，根據說明書的指示進行保存。比如具體保存溫度，是否要避光等。


小結：希望上面這些小貼士，能幫助大家成功完成免疫熒光染色實驗！