我的實(shí)驗(yàn)要重做竟然是因?yàn)椤八?/h1>

2020-04-15 11:56 作者：洛辰 來(lái)源：上海遠(yuǎn)慕生物試劑

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，真正困擾研究人員的是繁瑣的胰蛋白酶凍融流程：解凍儲(chǔ)存的胰蛋白酶、分裝成單次使用量、凍存分裝試劑、亞培養(yǎng)時(shí)再次解凍，這意味著科學(xué)家zui需要的是在冰箱外能保持穩(wěn)定、在廣泛的實(shí)驗(yàn)室溫度條件下仍具有活性的胰蛋白酶配方。

對(duì)科學(xué)家而言不僅是工具：論胰蛋白酶在實(shí)驗(yàn)室的重要性

生理學(xué)家認(rèn)為，胰蛋白酶等絲氨酸蛋白酶是存在于消化液中穩(wěn)定、關(guān)鍵的蛋白消化酶。zui早關(guān)于胰蛋白酶的描述是在19世紀(jì)末期，胰蛋白酶zui初作為胰蛋白酶原形成于胰腺，然后通過(guò)胰腺管到達(dá)十二指腸并剪切為活性形式。酶活性的封存可防止體蛋白的無(wú)選擇、不合需求的剪切，避免引起炎癥疾病如胰腺炎。

具有貼壁表型的細(xì)胞培養(yǎng)物

胰蛋白酶是一個(gè)有力的特異分子工具，在生命科學(xué)家的手中實(shí)現(xiàn)精確的蛋白剪切。關(guān)于胰蛋白酶在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用報(bào)告zui早出現(xiàn)于50多年以前。在細(xì)胞培養(yǎng)中，與胰蛋白酶短期孵育可以剪切蛋白，將貼壁培養(yǎng)細(xì)胞從培養(yǎng)平面和其他細(xì)胞上解離下來(lái)，從而將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板上移除，構(gòu)建單細(xì)胞懸液用于細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞傳代和其他下游實(shí)驗(yàn)。

特定應(yīng)用的胰蛋白酶：請(qǐng)更穩(wěn)定一些

除了細(xì)胞培養(yǎng),胰蛋白酶在生命科學(xué)領(lǐng)域還有很多其他用途。比如在蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)中，胰蛋白酶可將蛋白消化成多肽用于質(zhì)譜分析。在此應(yīng)用中，胰蛋白酶的特異性尤其有用，因?yàn)樗鼣嗔阎皇囚然诰彼峄蛸嚢彼釟埢系碾逆I。

然而，胰蛋白酶消化蛋白的異常活性有時(shí)也會(huì)給蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來(lái)一些問(wèn)題。如果不采取穩(wěn)定措施，胰蛋白酶zui終會(huì)進(jìn)行自我消化，這是大家zui不希望看到的，因?yàn)樽晕伊呀饪赡芪廴竞突煜龑?shí)驗(yàn)結(jié)果。

細(xì)胞培養(yǎng)新福利：一款適用于常規(guī)解離的熱穩(wěn)定配方

要為細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用開(kāi)發(fā)不自我剪切的熱穩(wěn)定性胰蛋白酶非常容易，為什么要為常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用開(kāi)發(fā)一款不同的穩(wěn)定胰蛋白酶配方呢？在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，避免使用可能污染質(zhì)譜結(jié)果的添加劑來(lái)穩(wěn)定胰蛋白酶是非常必要的，但對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，其面臨的問(wèn)題是不同的。但細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，真正困擾研究人員的是繁瑣的胰蛋白酶凍融流程：解凍儲(chǔ)存的胰蛋白酶、分裝成單次使用量、凍存分裝試劑、亞培養(yǎng)時(shí)再次解凍，這意味著科學(xué)家zui需要的是在冰箱外能保持穩(wěn)定、在廣泛的實(shí)驗(yàn)室溫度條件下仍具有活性的胰蛋白酶配方。

新配方胰蛋白酶不僅在4°C條件下穩(wěn)定，而且在室溫條件下也是穩(wěn)定的，甚至在37°C條件下仍能保持>90%的活性。StableCell?胰蛋白酶有3個(gè)不同的濃度(1x、5x和10x)，可根據(jù)不同的細(xì)胞粘附強(qiáng)度進(jìn)行優(yōu)化。而且與其他室溫解離試劑不同，這個(gè)新配方仍是豬胰腺胰蛋白酶，不需要在之前使用傳統(tǒng)胰蛋白酶配方的培養(yǎng)系統(tǒng)中再次進(jìn)行驗(yàn)證。

讓你的應(yīng)用成為你的指南：為什么胰蛋白酶的配方不盡相同？

許多實(shí)驗(yàn)室可能不管其應(yīng)用是什么，都直接購(gòu)買(mǎi)zui常用的胰蛋白酶配方：0.25%胰蛋白酶+EDTA，再加入酚紅作為pH指示劑。盡管不是典型的解離大部分貼壁細(xì)胞的強(qiáng)大試劑，但當(dāng)EDTA加入胰蛋白酶后提供了一種解離細(xì)胞的協(xié)同機(jī)制：EDTA結(jié)合移除細(xì)胞-表面以及細(xì)胞-細(xì)胞間的鈣，螯合培養(yǎng)基中抑制胰蛋白酶活性的游離Ca2+，從而降低胰蛋白酶的使用濃度，避免高濃度胰蛋白酶或過(guò)度孵育對(duì)細(xì)胞的傷害。胰蛋白酶在pH 7-9 范圍內(nèi)具有zui佳活性，因此配方中通常使用酚紅作為pH指示劑。然而，有些特殊應(yīng)用則需要選擇不含EDTA或酚紅的配方。

選擇和使用技巧：生命科學(xué)應(yīng)用的胰蛋白酶配方

為實(shí)現(xiàn)zui佳的細(xì)胞解離效果，下述技巧可幫助選擇正確的胰蛋白酶配方：

對(duì)于存在較高自身消化片段和污染物峰風(fēng)險(xiǎn)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，通過(guò)分子改進(jìn)（如重組配方）方法實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的胰蛋白酶是zui佳選擇。
在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中使用熱穩(wěn)定性胰蛋白酶配方可避免繁瑣的凍融分裝流程，避免出現(xiàn)丟棄不小心落在冰箱外的標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶而產(chǎn)生的浪費(fèi)。
標(biāo)準(zhǔn)和熱穩(wěn)定性胰蛋白酶配方通常都具有不同的胰蛋白酶濃度，使用為你的細(xì)胞推薦的zui低有效濃度。

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