1.3.2 染樣品法 同時(shí)制備四塊不加染料的1％瓊脂糖凝膠。待凝膠冷卻凝固后，放入同一電泳槽中。將分別將0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng、10 ng、20 ng及50 ng的DL 15 000＋2 000與4種染料混合，避光10 min.然后于不同泳道中加入。使用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳，最后用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

    1.3.3 后染法 同時(shí)制備四塊不加染料的1％瓊脂糖凝膠。待凝膠冷卻凝固后，放入同一電泳槽中。于不同泳道中分別加入0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng、10 ng、20 ng及50 ng的DL 15 000＋2 000.使用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳。電泳后將凝膠分別浸入用1×TAE稀釋的4種不同染液中。按照說(shuō)明書(shū)要求，GoldViewna II、GoldView、DNA Green及EB避光染色的時(shí)間分別為60 min、30 min、30 min、30 min.DNA Green染色完畢后還需用1×TAE脫色30 min.最后用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 染膠法

    染膠法的結(jié)果表明四種染料使用該法的靈敏度均最高，其中GoldViewna II能檢測(cè)到的DNA含量約為0.5 ng；EB能檢測(cè)到的DNA含量約為1 ng；GoldView與DNA Green能檢測(cè)到的DNA含量約為2 ng.

    2.2 后染法

    后染法的結(jié)果表明四種染料使用該法的靈敏度低于染膠法。其中GoldViewna II能檢測(cè)到的DNA含量約為1ng；EB能檢測(cè)到的DNA含量約為2 ng；DNA Green與GoldView能檢測(cè)到的DNA含量約為5 ng.圖2 使用后染法比較4種核酸染料染色DNA的靈敏度

    2.3 染樣品法

    染樣品法的結(jié)果表明四種染料使用該法的靈敏度最低。其中GoldViewna II能檢測(cè)到的DNA含量約為2 ng；EB與DNA Green能檢測(cè)到的DNA含量約為5 ng、GoldView能檢測(cè)到的DNA含量約為10 ng.

    3 討論

    GoldViewna II是國(guó)內(nèi)近年來(lái)推出的新型核酸染料，與SYBR Green I同屬花青類染料。SYBR Green I是幾年前推出的一種高靈敏度［3］且不具有強(qiáng)致突變性［4］的核酸染料，但由于其高昂的價(jià)格限制了它的廣泛使用。上述實(shí)驗(yàn)表明GoldViewna II的靈敏度高，同時(shí)具有花青類染料不具強(qiáng)致突變性的優(yōu)點(diǎn)，價(jià)格也比SYBR Green I便宜數(shù)倍。雖然其穩(wěn)定性不如EB［3］且反復(fù)凍融效果變差，但只需要-20℃避光保存和分裝使用即可。

    DNA Green是國(guó)內(nèi)最近才推出的新型核酸染料。它的靈敏度與EB相當(dāng)?shù)尘奥愿哂贓B，但該染料的價(jià)格比GoldViewna II還便宜且穩(wěn)定性比較好，4℃避光保存即可。

    GoldView是國(guó)內(nèi)較早使用的新型核酸染料，它的靈敏度比EB略低且背景太高。不適合做微量的DNA檢測(cè)。但該染料穩(wěn)定性也比較好，4℃避光保存即可，價(jià)格是這三種染料中最便宜的。

    這些新型核酸染料均可替代EB廣泛使用，從而減少大量使用EB對(duì)人體的危害和對(duì)環(huán)境的污染。使用者可以根據(jù)自己的需要選擇合適的染料。

    染色方法比較可以看出：染膠法的檢測(cè)靈敏度最高；后染法的檢測(cè)靈敏次之；染樣品法的檢測(cè)靈敏度最低，不適合做微量DNA檢測(cè)。此外，后染法用于新型核酸染料很不合適。花青類染料用于后染法需要將染料用1×的電泳緩沖液稀釋到聚丙烯容器中，在避光條件下該溶液最多可以在24小時(shí)內(nèi)被使用且染2～3塊凝膠后其靈敏度會(huì)降低，結(jié)果略。這樣的結(jié)果導(dǎo)致染料的巨大消耗，成本太高。DNA Green用于后染的工作濃度為10×，也就是染料用量提高10倍即成本增加10倍，而且在染色半小時(shí)后，由于其高背景還需要脫色半小時(shí)，延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。既往有研究推薦使用后染法的原因是染色的DNA帶型平直不扭曲［2］。我們的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)得出，電泳時(shí)控制合適的電壓和上樣量，新型核酸染料使用染膠法也能達(dá)到同樣效果。故使用新型核酸染料染色DNA時(shí)推薦采用染膠法。