一、實驗目的

    1．熟悉常用微生物培養基的配制方法。

    2．學習并掌握各種無菌操作技術，并用此技術進行微生物稀釋分離、劃線分離接種。

    3．用平板劃線法和稀釋法分離微生物。

    4．認識微生物存在的普遍性，體會無菌操作的重要性。

    二、實驗原理

    (一)微生物的分離與純化

    土壤是微生物生活的大本營，在這里生活的微生物無論是數量還是種類都是極其豐富的。因此，土壤是微生物多樣性的重要插所，也是發掘微生物資源的重要基地，可以從土壤中分離、純化得到許多有價值的菌株。

    從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的是平板分離法。為了獲得某種微生物的純培養，一般是根據該微生物對雪養、酸堿度、濃度和氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養條件，或加入某些抑制劑抑制其他菌生長而利于此菌生長的環境，從而淘汰其他一些不需要的微生物．再用稀釋涂布平板法或稀釋后平板劃線分離，純化該微生物，直至得到純菌株。

    (二)平板菌落計數法

    平板菌落計數法是將待測樣品經適當稀釋，使其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經過培養，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞．統計菌落數，根據其稀釋倍數和取樣接種量即可換算出樣品含菌數。

    平板菌落計數法雖然操作繁瑣，結果需要培養一段時間才能取得，而且測定結果易受多種因素的影響，但是，由于該計數方法的最大優點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數或污染程度的檢測。

    三、實驗材料

    土樣10g，未知菌變形桿菌單菌落平板和無菌水．

    取液器(5m1、l000ml各一支)，培養箱，培養皿(20個)，無菌有帽試管，三角瓶，無菌涂棒，接種環，5ml、1ml無菌吸頭（移液管），記號筆，酒精燈，火柴，試管架，牙簽，。

    四，實驗步驟

    (一)培養基的制備(提前準備)

    按以下步驟制備牛肉膏蛋白胨平板培養基，每組20個平板。配方參見附錄I．

    1．培養基的制備原則：適當的營養成分；合適的酸堿度，配制后經滅菌手續方可使用．

    2．培養基配制的基本程序：稱量一溶化一測定及矯正pH一過濾一分裝—滅菌備用(若配制固體平板培養基，則先滅菌后再傾倒平板備用)。

    3．培養基制備過程

    (1)稱量：按配方及配制的總量計算各種成分所需的量分別稱取。

    (2)溶解；將各種成分放入三角瓶(三角瓶體積要大于所裝培養基體積2倍為宜)中，加自來水(一般配完全培養基用)或蒸餾水至所配培養基的總量，在微波爐中加熱溶解，觀察液體沸騰情況，在液體溢出之前，馬上斷開電源，反復多次，直到完全溶解。

    (3)調pH值：初溶解好的培養基pH可能不符合要求，需用lmol／L NaOH或lmol／LHCI調pH至所需范圍，

    (4)過濾：趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利于結果觀察．一般無特殊要求的情況下，這一步可以省去(本實驗無需過濾)。

    (5)分裝；按實驗要求，可將配制的培養基分裝入試管或三角瓶內。

    液體分裝：分裝體積不超過三角瓶體積一半。

    固體分裝：培養基高度為試管的1／3為宜，配斜面培養基時，一般每試管(直徑為10mm)加5ml左右培養基。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。

    半固體分裝：培養基高度為試管高度的1／3為宜。

    (6)加塞、包扎和滅菌；分裝后，試管用試管帽，三角瓶用無菌培養容封口膜（棉塞）封好瓶口，作好標記，注明培養基的名稱及配制日期。放人高壓滅菌鍋內，加熱沸騰，排空鍋內空氣，以蒸汽劇烈噴出為準，然后升壓到0.1MPa、穩壓0.11MPa(121"C)滅菌20min，或全自動高壓滅菌鍋中設定121"C、15~20min滅菌，如果培養基體積較大或含有糖蜜等容易受污染的營養復合物時，可適當延長滅菌時間．

    (7)擺斜面和倒平板；制斜面培養基時，應在未凝固前將試管有塞的一頭擱在試管架底層、試管底部擱在桌面，形成斜面，斜度要適當，斜面長度約為試管長度的1／2，培養基上部離管口5cm以上，凝固后即成斜面．制平板培養基時，可將培養基冷卻至60～70℃，無菌操作將培養基倒人已滅菌并干燥的培養皿中，讓其自然流滿整個子皿底或輕輕搖動培養皿，使其布滿平皿底，蓋上平皿盞，水平靜置，等凝固后翻轉培養皿．每平皿裝量 15~20ml (490mm)，使厚度達2~3mm。倒平板時，一般疊放培養皿，以免過多蒸汽凝結在皿蓋上。

    (8)無菌檢查；特制好的培養基置37℃溫箱孵育24h，如無雜菌生長即可使用(此步一般省略)．

    (9)較長時間不用的斜面或平板可用鋁箔包好，放置4"C冰箱備用．

    （二)周圍環境中微生物的檢測

    在牛肉膏蛋白胨培養基平板上作如下實驗：

    l，取一個平板，分成4區，做好標記(下同)．用未洗過的手指頭以及肥皂洗過1次、2次、3次的手指頭(不用毛巾擦)分別在4個區上涂抹(用力一致)。

    2．取一個平板，分區,用正在使用的紙巾、硬幣分別在不同的區上拖動2～3次。

    3．往培養基上放置一根頭發，并用無菌涂布器壓緊。

    4．取一個子板，將稍稍打開的嘴唇在培養基上壓一下，檢查嘴唇上的細菌。

    5．取一個平板，分區，用無菌接種環分別沾一環自來水、河水以及礦泉水在平板不同區上畫線。

    6．用無菌牙簽取一點牙垢在一個平板培養基上畫線。

    7．取兩個乎板，一個打開皿蓋，置實驗臺上(空氣中)l0min，另一個按無菌操作要求在酒精燈火焰邊打開皿蓋lmin。

    8．取一個平板，打開皿蓋，對著培養基咳嗽。

    9．另兩個平扳可根據自己的興趣，自由用來檢測。

    以上平板用報紙包好倒置于37℃培養箱里培養24h觀察結果。

    任何一個實驗，在動手操作前均需先用記號筆在培養皿底做好標記。標記包括培養物名稱、班級、姓名、日期．標記應明了、占地少，并做在乎皿底邊緣，不要做在中間，以免影響結果觀察。

    本組的平板要統一用報紙包好，在外面寫上組號，以免同學拿亂，找不到自己的平板。

    (三)從土壤中分離微生物

    1． 采土樣：選擇較肥沃韻土壤，鏟去表層土，挖5~20cm深度的或特殊要求的土壤數十克，裝入已滅菌的牛皮紙袋，封好袋口，做好編號記錄，帶回實驗室供分離用。

    2． 制備土壤稀釋液，稱取土樣1.0g，放人盛99ml無菌水井帶有玻璃珠的三角瓶中，置搖床振蕩5min使土壤均勻分散成為土壤懸液(10-2)。用1ml的無菌吸頭從中吸駐0.5ml土壤懸液，注人事先分裝有4.5ml無菌水的試管中，吹吸3次，振蕩均勻(10-3)。換一只新的無菌吸頭，用同樣方法，分別配置成稀釋度為10-4、10-5、10-6的土壤溶液。

    3． 涂布：用一只新的無菌吸頭，分別由各濃度土壤稀釋液中各吸取100μ1，對號較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉蛋白胨培養基平板上，用無菌玻璃涂棒涂勻，一定要多涂幾遍，從概率角度來說，涂到細菌均勻分布為止，此步是實驗成功的關鍵。每個濃度做3個平板。

    4． 培養：將牛肉蛋白胨培養基平板倒置于37℃溫箱中培養24h，統計所長出的菌落數．

    5． 菌落計數；培養24h后，取出培養乎板，算出同一稀釋度三個平扳上的菌落平均數，換算出土樣中的菌含量。

    有較大片菌苔生長時，棄用，以無大片菌苔生長的培養皿計數；如成片菌苔大小不到培養皿的一半，其余一半分布均勻，將此一半計數×2。

    選擇平均菌落數在30~300間的平板。只有一個濃度符合此范圍時，以該平均菌落數乘稀釋倍數即為該樣品中菌總數；有兩個濃度平板的菌落數在30-300時，按兩者菌落總數比值決定：比值小于2，取平均，比值大于2，取較少的菌落總數：

    所有菌落數均大于300，取稀釋度最高的平均菌落數乘稀釋倍數；

    所有菌落數均小于30，取稀釋度最低的平均菌落數乘稀釋倍數．

    所有菌落數均不在30~300間，以最接近30或300的平均菌落乘以稀釋倍數．