客戶提供

    基因序列或蛋白質氨基酸序列

    最終交付

    約4 μg含有目的片段的高純度凍干質粒DNA；

    含有重組質粒的穿刺菌一管（TOP10）；

    發貨文件主要包括如下內容：測序結果、COA報告、sqd文件。

    備注：默認合成克隆基因至pUC57載體

    鄭重承諾：對客戶提供的核酸/氨基酸序列或基因合成的結果沒有所有權，并承諾對結果嚴格保密，且不會以任何形式散布到第三方。

    載體選擇主要考慮下述3點：

    1、構建DNA重組體的目的，克隆擴增/表達表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。

    2、載體的類型：

    （1）克隆載體的克隆能力—據克隆片段大小（大選大，小選小）。尤其對于病毒載體來說，載體包裝容量的大小是評估能否成功包裝病毒的首要因素。

    ①腺病毒可以插入長約8kb的外源基因。目前，我們包裝過長度為7.5kb外源基因的腺病毒。

    ②慢病毒的包裝容量約為6kb（包含載體帶有的其他抗性基因或報告基因），但是2kb以上的外源基因包裝慢病毒難度就增加了，增大1kb會下降1個單位數量級的滴度，故2kb以上的基因包裝慢病毒需要進行評估。此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白（作為受體、轉運蛋白行使功能）等由于其本身的功能，包裝可能會有一定難度。

    ③AAV的總包裝容量是4.7 kb（包含載體中兩個ITR約0.3kb +具體啟動子 + 內含子約0.6kb + 具體熒光標簽 + polyA約0.2kb），所以插入目的基因一般約2kb 左右。由于AAV包裝容量有限，目的基因大于2kb，可考慮去除內含子，因為內含子只是有助于插入的目的基因穩定表達。

    （2）確定表達蛋白的目的，然后再來選擇優勢的表達質粒。一般分為原核表達和真核表達質粒，前者主要用于體外純化蛋白，如帶His-tag的PET系列，帶GST-Tag的PGEX系列，選用不同的表達載體，就得建立相應的純化系統，包括緩沖液的配置、珠子/柱子的選擇等等，還得考慮目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。這種原核純化的蛋白一般用來制備單一的、需要量大的蛋白。真核表達載體一般是細胞、體內表達等需要時所用，只需要將它放到細胞或體內細胞即可，唯一考慮的是它的啟動子的選擇，常用都是cmv啟動子的，表達效率較高，也有多種啟動子經過改造的表達載體，一般用來表達需要調控表達時間及表達量的蛋白。

    3、載體MCS中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易于連接，不產生閱讀框架錯位。

    ①選分子量小的質粒，即小載體（1-1.5kb）→不易損壞，在細菌里面拷貝數也多（也有大載體）；

    ②一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束，一般10個以上的拷貝，而嚴謹型質粒<10個；

    ③必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；

    ④必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因。