細胞培養(yǎng)時中常遇到的那些不可忽視的問題，及我們該如何解決呢？

一、細胞的營養(yǎng)來源

針對大多數(shù)腫瘤細胞，營養(yǎng)配方一般為：90%合成培養(yǎng)基（DMEM、RPMI1640、MEM等）和10%胎牛血清(FBS)；為了防止污染，可以加1%雙抗！

常見問題解答：

Q：針對不同細胞，細胞培養(yǎng)基配方一樣嗎？如何獲知呢？

A：不同細胞的培養(yǎng)基是不同的。一般ATCC購買的細胞，針對不同細胞株，會有詳細介紹，包括生長的狀態(tài)圖、培養(yǎng)基的類型等。如人源乳腺癌細胞MCF-7細胞一般為1640，人源肺癌細胞A549可用DMEM培養(yǎng)基。

Q：培養(yǎng)基為什么一般都是偏紅色？

A：因為培養(yǎng)基加了酚紅來顯示顏色，指示pH范圍為6-8，顏色會由黃變?yōu)樽霞t。這是為了我們能更直觀觀察培養(yǎng)液的變化，如變黃，則代表偏酸，偏堿性了就顯示偏紫色。一般來說，細胞吸收營養(yǎng)后，變黃后就暗示我們要換培養(yǎng)基啦！所以密切觀察很重要哦！

Q：大多數(shù)細胞系可以在不止一種培養(yǎng)基中生長，那可以替換嗎？

A：不建議更換ATCC指定的培養(yǎng)基，因為當(dāng)培養(yǎng)基改變時，細胞的性質(zhì)可能也會變化。

Q：若是細胞生長緩慢，是否可以增加血清比例？

A：可以！
二、細胞的居住環(huán)境

舒適無菌的環(huán)境是細胞健康生活的重要基礎(chǔ)。如下圖為培養(yǎng)細胞的器皿，包括形狀、規(guī)格、用途多樣的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板。最終住進37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱。

常見問題解答：

Q：細胞培養(yǎng)板規(guī)格不一，如何正確選用？

A：根據(jù)不同規(guī)格的細胞培養(yǎng)皿/板容量及用途，如流式一般用 6 孔，爬片一般用 24 孔，MTT 一般用 96 孔，等。

Q：細胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶區(qū)別？

A：就細胞培養(yǎng)狀態(tài)來說，培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿沒有太大區(qū)別，主要在于安全系數(shù)（培養(yǎng)瓶＞培養(yǎng)皿）、培養(yǎng)細胞數(shù)量（大培養(yǎng)瓶＞培養(yǎng)皿）。但是培養(yǎng)瓶成本也會相對較高，因此無特殊要求，一般選擇培養(yǎng)皿即可。

三、細胞的復(fù)蘇與凍存（原則是慢凍速融）

1. 細胞復(fù)蘇：指將凍存的細胞解凍之后重新培養(yǎng)，細胞恢復(fù)生長的過程。

常見問題解答：

Q：為什么細胞復(fù)蘇后，很多難以貼壁？

A：忽略培養(yǎng)基的問題，主要考慮細胞凍存時狀態(tài)差或者復(fù)蘇時動作太慢導(dǎo)致細胞死亡。切記最重要的融化速度要快，可不時搖動冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段（-5～0℃）。

Q：為什么細胞貼壁了，卻長不起來？

A：此時需要考慮的是細胞密度問題，一些細胞傾向于維持一定的密度，若復(fù)蘇的細胞生長緩慢，可將細胞轉(zhuǎn)移到較小的培養(yǎng)瓶/皿中培養(yǎng)。                                          

2. 細胞凍存 將細胞放在低溫環(huán)境（-70℃~-196℃），細胞內(nèi)的代謝降低，可最大限度的保存細胞活力，以便長期儲存。

常見問題解答：

Q：目前細胞凍存液多采用的什么配方？

A：目前細胞凍存多采用DMSO二甲基亞砜或甘油作保護劑，細胞凍存液的配方有很多種，如培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高濃度血清有助于維護細胞活力，復(fù)蘇存活率在80%～90%以上。

Q：若沒有細胞凍存盒，我們該怎么辦？

A：可先將凍存管放入4℃冰箱中10min，再移至-20℃冰箱30min，-80℃冰箱2h或過夜，最后放入液氮罐內(nèi)。為了節(jié)約時間，還可直接在凍存盒外包裹一團棉花，用棉花代替凍存盒緩慢降溫的特點，將細胞轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱過夜，再轉(zhuǎn)移至液氮保存。

Q：細胞凍存時對細胞量有要求嗎？

A：細胞復(fù)蘇時會有一定的細胞死亡，因此細胞的濃度應(yīng)足夠高，起始濃度106—107個/ml/管；

四、細胞的傳代培養(yǎng)

細胞傳代：細胞在培養(yǎng)過程中不斷增殖，培養(yǎng)皿/瓶空間有限，當(dāng)細胞接觸過密，生長就會受到抑制，影響細胞狀態(tài)，因此我們要把其中一部分細胞分到別的培養(yǎng)皿/瓶里。

常見問題解答：

Q：為什么我們總說選擇對數(shù)期細胞傳代？

A：細胞的生長和分裂，一般遵循以下模式：停滯期，對數(shù)期（指數(shù)期），平穩(wěn)期（平臺期）和衰退期。為了確保活力，遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定，必須使細胞保持在對數(shù)期。

Q：那如何確定細胞對數(shù)期？

A：根據(jù)上述細胞生長曲線，為了確保活力，必須使細胞保持在對數(shù)期就傳代，所以一定不能等到細胞長滿100%融合時才去消化傳代。一般細胞長到 70% -80%左右即可傳代。

Q：一般細胞傳代都是1分2嗎？

A：要根據(jù)不同細胞而定，如有的生長很快，比如說4T1細胞，傳代取離心懸液的十分之一就已經(jīng)足夠了。有的又特別慢，比如 BT474。此時我們就要多觀察摸索最合適的傳代比例。

Q：消化很關(guān)鍵嗎？

A：不得不說，細胞狀態(tài)差，很多時候與傳代時胰酶消化密切相關(guān)。一般腫瘤細胞消化1-2min即可。但是每一種細胞貼壁能力不同，因此對胰酶的反應(yīng)也不同，我們需要密切跟蹤。一般肉眼觀察到貼壁細胞層能移動即可終止；而非細胞全部分散成單個。

Q：部分比較難消化的細胞怎么辦？

A：可放于37℃培養(yǎng)箱消化。以MDA-MB-231/PAX紫杉醇耐受細胞為例，放于37℃培養(yǎng)箱消化5-8min，輕輕拍打，才見細胞成片移動，因此針對難消化細胞一定要在顯微鏡下密切觀察。

Q：幾天換培養(yǎng)基？

A：正常情況下，培養(yǎng)液偏紅色。如果細胞維持在pH6.5～6.6條件下，培養(yǎng)基變黃，說明培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物已堆積到一定量，細胞會脫落死亡，需要更換新鮮培養(yǎng)液。一般細胞生長旺盛時1～2天換一次，生長緩慢時，3～4天亦可。針對復(fù)蘇后的細胞，建議隔天換液。

Q：每天觀察細胞有必要嗎？

A：一般的腫瘤細胞我們是隔天傳代，但是切不可忽略對細胞的觀察，一定要每天都要去看一下細胞，肉眼觀察培養(yǎng)基狀況、顯微鏡下觀察細胞生長狀況。記住，是每天。

Q：如果細胞形態(tài)不清晰或有異物等，如何處理？

A：可以考慮如下操作：首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，用新的培養(yǎng)基或者PBS洗滌2-3次，再開始正式的消化、吹打。其次，把吹打下來的細胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。后續(xù)再密切觀察。

Q：細胞污染怎么辦？

A：如發(fā)現(xiàn)細胞有污染，一般應(yīng)立即丟棄。如果細胞非常寶貴，可試著加入含抗生素的培養(yǎng)基反復(fù)清洗，并用抗生素含量高的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基.