三代測序技術興起已經不是一天兩天的事情，可是好多小伙伴對它的認知好像僅僅限于一個名詞，沒有具體去深入了解過，以為可能就是跟現在的二代測序技術沒有什么差別，只是升級版而已，小編很負責任的告訴你，在你不知道的時間里，它已經成為科研領域不可或缺的一種主流技術，廣泛應用于基因組Denovo、全長轉錄本檢測、宏基因組、重測序和變異檢測等多個方向，并且在染色體結構變異（SV）的檢測中有著不可替代的優勢。

特別是隨著近兩年 eccDNA（extrachromosomal circular DNA）即染色體外環狀DNA成為科研界的寵兒，三代測序技術更是被推上了浪潮的尖端。




第三代測序技術主要有兩大技術：

第一是單分子實時熒光測序，脫氧核苷酸用熒光標記，顯微鏡可以實時記錄熒光的強度；當熒光標記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時候，它的熒光就同時在DNA鏈上被探測到；當它與DNA鏈形成化學鍵的時候，它的熒光基團就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標記的脫氧核酸不會影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。

優點：

（1）可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間，來檢測一些堿基修飾情況，即如果堿基存在修飾，則通過聚合酶時的速度會減慢，相鄰兩峰之間的距離增大，可以通過這個來直接檢測甲基化等信息

（2）測序速度很快，每秒約10 個dNTP

（3）讀長長（約50kb）：超長讀長可獲得mRNA全長序列及完整結構信息，提高拼接效率，轉錄本無需拼接；克服無參考基因組物種轉錄本拼接短、信息不完整的難題；實現有參考基因組物種研究可變剪切及融合基因等結構變異。精準重構轉錄組/基因組全貌

（4）直接對原始DNA/RNA樣本測序，無需PCR擴增，無GC偏好性

（5）需要的樣品量很少，樣品制備時間花費少

缺點：

（1）測序錯誤率比較高（這幾乎是目前單分子測序技術的通病），達到15%

好在它的出錯是隨機的，并不會像第二代測序技術那樣存在測序錯誤的偏向，因而可以通過多次測序來進行有效的糾錯

（2）依賴DNA聚合酶的活性

（3）成本比二代測序較高

第二是納米孔測序，新型納米孔測序法（nanopore sequencing）是采用電泳技術，借助電泳驅動單個分子逐一通過納米孔來實現測序的；由于納米孔的直徑非常小，僅允許單個核苷酸聚合物通過，而ATCG單個堿基的帶電性質不一樣，通過電信號的變化差異就能檢測出通過的堿基類別，從而實現測序。

優點：

（1） 測序讀長：大約在幾十kb，甚至100 kb，理論上只要DNA分子不斷開就可以一直通過納米孔（比如很火的eccDNA，往往比較大，并且往往攜帶多個染色質來源的序列，因此僅用二代測序很難完整構建出eccDNA的全長序列。三代測序技術顯著提高了測序中分子讀長的問題，可以用于eccDNA的全長序列鑒定）

（2） 可以直接讀取甲基化的胞嘧啶，不必像二代測序那樣需要對基因組進行bisulfite處理（怎么理解：也就是用三代測序做一個全基因組測序的話，可以同時有DNA甲基化的數據分析）

（3） 測序通量很高(30x人類基因組有望在一天內完成);

（4） 起始DNA在測序過程中不被破壞;

（5） 以及樣品制備簡單又便宜

缺點：

（1） 測序準確率：Nanopore測序準確率和Pacbio持平，為86%左右。而且起始位置正確率偏低，在大約100nt位置達到穩定，且錯誤為隨機測序錯誤。如果是對DNA正負鏈都進行測序，可以達到96%的準確率

（2） 切斷的核苷酸可能被讀錯方向