在無數(shù)實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)中，制備高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液被公認(rèn)為重中之重。實(shí)驗(yàn)過程中，如單細(xì)胞活性不高，細(xì)胞數(shù)過低，以及污染和雜質(zhì)等問題，都會(huì)影響到有效單細(xì)胞數(shù)的產(chǎn)出、單細(xì)胞核酸的質(zhì)量等，最終得到的單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)結(jié)果不可信。

那么，組織如何解離？需要選什么酶？還需要注意什么？科技君根據(jù)相關(guān)權(quán)-威文獻(xiàn)整理了單細(xì)胞懸液制備的方法和小貼士，讓我們一起來解決單細(xì)胞研究方案中的攔路虎。

實(shí)體組織解離關(guān)鍵——酶的合理選擇

實(shí)體組織解離兩大步驟，包含機(jī)械分離和酶消化處理。

首先，組織需要通過物理切割或刀片切碎，然后通過酶消化來分離細(xì)胞。特定的組織消化酶及消化時(shí)間不同，相關(guān)建議可參考如下表格：人和小鼠的部分組織類型——肝臟、肺、皮膚、脾臟、消化道、胰腺、腎臟、視網(wǎng)膜等[1]。

表1 人鼠各類型組織酶解單細(xì)胞懸液方法總結(jié)[1]

除此之外，常用酶的類型還包括：Accutase?、彈性蛋白酶和膠原酶，以及商業(yè)酶混合物，如 TrypLE Express 和 Liberase Blendzyme 等[1]，

另外，科技君也總結(jié)已發(fā)表文獻(xiàn)中常見實(shí)體組織解離所采用的酶，供大家參考，步驟詳見參考文獻(xiàn)：

小鼠心臟肌肉組織：Collagenase IV and Dispase II[2]
上皮組織：dispase(Corning) -商業(yè)化試劑[3]
小鼠胚胎組織：TrypLE Express[4]
乳-腺癌及其癌旁組織:  Liberase TL (Sigma) -商業(yè)化試劑[5]
小鼠主動(dòng)脈血管：Collagenase type II (C6885, Sigma Aldrich) 和 Elastase (LS002292, Worthington Biochemistry)[6]
小鼠腦垂體：Collagenase type II, trypsin， DNase I，amphotericin B 混合[7]

血液處理成關(guān)鍵——離心穩(wěn)定操作[1]

樣品經(jīng)過密度離心(例如使用Ficoll-Paque或Histopaque-1077技術(shù))，可以直接用于外周血單核細(xì)胞（PBMC）捕獲[1]。

建議不少于5mL EDTA 抗凝血，且不要使用肝素抗凝管收集血液；同時(shí)注意在合適轉(zhuǎn)數(shù)離心操作后，管中內(nèi)容物分為三層，上層為血漿（內(nèi)含細(xì)胞碎片），中間層為分層液，底層為紅細(xì)胞，在上、中層液體界面處可見到乳白色混濁的單核細(xì)胞層（ 白膜層，薄）。此時(shí)，需使用無菌吸管小心沿離心管壁周緣吸取界面層單核細(xì)胞后，再加入HBSS /PBS重懸。更多注意事項(xiàng)請(qǐng)參見華大科技單細(xì)胞送樣建議。

單細(xì)胞懸液制備的8條建議[1]

1. 建議采用無菌樣品處理方式，包括使用不含核酸酶的試劑和耗材。

2. 為降低對(duì)細(xì)胞的損傷，移液和離心應(yīng)保持在最低程度。在一定的離心速度、時(shí)間和溫度下，細(xì)胞濃度和大小直接影響制備的效率。

3. 在進(jìn)行細(xì)胞清洗和重懸過程中，使用具有合適大小的器皿，避免高濃度導(dǎo)致細(xì)胞集聚和結(jié)塊，請(qǐng)注意選擇。

4. 應(yīng)使用適當(dāng)大小的細(xì)胞過濾器過濾懸浮液，孔徑大于細(xì)胞直徑，以去除團(tuán)塊和碎片。

5. 細(xì)胞清洗和復(fù)蘇，推薦使用含牛血清的磷酸鹽緩沖鹽水(不含鈣和鎂)，減少細(xì)胞損失和聚集的白蛋白。

6. 細(xì)胞裂解升高可導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)塊形成，在細(xì)胞分離過程中，DNase I可減少細(xì)胞團(tuán)塊形成。

7. 細(xì)胞團(tuán)塊會(huì)導(dǎo)致自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器低估單個(gè)細(xì)胞的有效濃度，因此制備后應(yīng)盡快處理懸浮液，最-好在30分鐘內(nèi)處理。

8. 總之，在單細(xì)胞制備中，盡可能減少細(xì)胞聚集物、死亡細(xì)胞、非細(xì)胞核酸和逆轉(zhuǎn)錄(RT)抑制劑是非常重要的。為了在最大限度地提高不同細(xì)胞類型的純度和無偏回收率的同時(shí)，最小化這些污染物，可能需要應(yīng)用優(yōu)化，例如，調(diào)整洗滌步驟的數(shù)量、洗滌溶液的組成、離心條件和/或過濾器類型。