1.微生物測(cè)序設(shè)置生物學(xué)重復(fù)的意義是什么？一般情況下，設(shè)置多少個(gè)重復(fù)合適？

生物學(xué)重復(fù)是指樣本重復(fù)，比如3只小鼠，同時(shí)做同一個(gè)處理，就是三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。生物學(xué)重復(fù)對(duì)于測(cè)序的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及后續(xù)信息分析都非常重要，設(shè)置生物學(xué)重復(fù)主要有以下幾個(gè)作用：

1）能夠消除組內(nèi)誤差：生物學(xué)重復(fù)可以測(cè)量變異程度；

2）增強(qiáng)結(jié)果的可靠性：測(cè)序的樣本越多，越能夠降低背景差異，從而增加結(jié)果可信度；

3）檢測(cè)離群樣本：異常樣本的存在，會(huì)嚴(yán)重影響測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，通過(guò)后續(xù)信息分析可以發(fā)現(xiàn)異常樣本，將其排除。

一般情況下，自然環(huán)境中（比如土壤，根系，植物等）及模式動(dòng)物（比如大鼠，小鼠等）建議每組至少5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，一般推薦10個(gè)生物學(xué)重復(fù)；若是人類(lèi)腸道，糞便等樣品，由于個(gè)體之間差別較大（比如環(huán)境，飲食，遺傳條件，健康狀態(tài)等影響），建議加大取樣量，每組不少于30個(gè)生物學(xué)重復(fù)（取樣少，可能會(huì)導(dǎo)致組內(nèi)差異大于組間差異則項(xiàng)目無(wú)意義）。值得注意的是，如果將多個(gè)樣本混在一起建庫(kù)測(cè)序，多個(gè)樣本則變成了一個(gè)樣本，仍是無(wú)生物學(xué)重復(fù)的。

Tips：一般建議多做生物學(xué)重復(fù)，若是遇到個(gè)體之間差別較大的情況可以選擇剔除個(gè)別樣本，避免后期樣本數(shù)量不夠，后期補(bǔ)送重復(fù)性不好的情況發(fā)生。
 
2.16S 測(cè)序物種注釋常用的數(shù)據(jù)庫(kù)有哪些？這些數(shù)據(jù)庫(kù)的特點(diǎn)（或優(yōu)缺點(diǎn)）是什么？

微生態(tài)研究，是研究微生物之間以及微生物與環(huán)境之間相互關(guān)系，其主要研究對(duì)象包括真菌，細(xì)菌，古菌和病毒等。對(duì)于獲得的大量16S rRNA測(cè)序序列，得到可靠的物種分類(lèi)結(jié)果與全面的數(shù)據(jù)庫(kù)是密不可分的。16S測(cè)序物種常用的數(shù)據(jù)庫(kù)有RDP， SILVA ，Greengenes，NT-16S（NT庫(kù)提取整理16S序列數(shù)據(jù)庫(kù)）等

3.16S 物種分類(lèi)學(xué)注釋中，常得到 UNCLASSIFIED，NO_RANK，OTHERS 等意義？

雖然理論上所有的微生物序列都應(yīng)當(dāng)能在種甚至菌株水平得到鑒定，但由于微生物種類(lèi)繁多，目前上述常用數(shù)據(jù)庫(kù)還很難包羅萬(wàn)象。加上二代測(cè)序讀長(zhǎng)的限制，往往只能選擇16S rRNA 1-3個(gè)高變區(qū)（目前常用的擴(kuò)增片段V3-V4區(qū)/V4區(qū)）作為擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，分類(lèi)的精確性受到一定的限制（某些物種高變區(qū)也可能十分相近，能夠區(qū)分它們的特異性序列片段有可能不在擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)，因此在鑒別的過(guò)程中受到測(cè)序長(zhǎng)度的限制），因此，在實(shí)際分析過(guò)程中，并非所有OTU代表序列都能獲得屬或種水平的分類(lèi)學(xué)信息（即在對(duì)應(yīng)的分類(lèi)學(xué)水平尚且屬于 “Unclassified”）。另外，也總是有可能遇到某些較為新奇、尚未被充分研究的微生物（在較高分類(lèi)水平，比如門(mén)水平鑒定為“Unclassified”），此為正常現(xiàn)象。

4.OTU 是什么？作用是什么？16S 多樣性測(cè)序引物該怎么選擇？

OTU（operational taxonomy unit）操作分類(lèi)單元，在微生態(tài)研究中，為了便于分析，人為給定某一分類(lèi)單元（品系，種，屬等）設(shè)置的同一標(biāo)志。簡(jiǎn)單的說(shuō)，OTU類(lèi)似于種，是根據(jù)高變區(qū)序列比對(duì)得出的，一般將相似度大于97%的序列聚為一類(lèi)，稱(chēng)為同一個(gè)OTU。

通常情況下，將來(lái)自同一環(huán)境的所有樣品序列進(jìn)行合并，將序列之間相似性大于97%（相當(dāng)于物種分類(lèi)種水平之間的序列差異）歸類(lèi)為一個(gè)OTU，理論上來(lái)說(shuō)，每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)于一個(gè)不同的16S rDNA序列，也就是每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)于一個(gè)不同的物種。通過(guò)OTU聚類(lèi)分析，不僅可以簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)還可以得到樣品中的微生物多樣性以及不同微生物的豐度。

5.ALPHA 多樣性和 BETA 多樣性在微生物檢測(cè)中的意義？

對(duì)群落多樣性、生態(tài)多樣性的研究主要應(yīng)用多樣性指數(shù)來(lái)進(jìn)行比較，常用的指數(shù)包括alpha多樣性指數(shù)和beta多樣性指數(shù)。

alpha多樣性是指一個(gè)特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，主要關(guān)注局域均勻生境下的物種數(shù)目，因此又稱(chēng)為生境內(nèi)的多樣性。alpha多樣性常用的指數(shù)有四種：Observed species，Chao1，Shannon，Simpson。

其中Observed species指數(shù)是指樣本中實(shí)際包含的OTU數(shù)目，chao1指數(shù)是指估算樣本中OTU的數(shù)目，這兩個(gè)指數(shù)均反映樣本中OTU（物種）數(shù)目的高低，這兩個(gè)指數(shù)越高表明樣本中的物種豐富度越高。Shanon指數(shù)是用來(lái)描述OTU出現(xiàn)的紊亂和不確定性，不確定性越高，多樣性指數(shù)越高，Simpson指數(shù)是指從樣品中隨機(jī)取兩條序列，這兩條序列屬于不同的OTU的概率，如果樣本中只有一個(gè)OTU，Simpson指數(shù)為0，多樣性最低。Shannon和Simpson指數(shù)不僅反映了樣本中物種的數(shù)量（即豐富度）又反映了樣本中各物種的豐度分布情況（即均勻度）。總之，樣品中OTU數(shù)目越多，OTU豐度分布越均勻，多樣性指數(shù)越高。

beta多樣性指沿環(huán)境梯度不同生境群落之間物種組成的相異性或物種沿環(huán)境梯度的更替速率，也被稱(chēng)為生境間的多樣性，主要是衡量群落之間的差別。beta多樣性的意義在于：

1）它可以反映生境變化的程度或指示生境被物種分割的程度；

2）beta多樣性的高低可以用來(lái)比較不同生境的多樣性。

總的來(lái)說(shuō)，alpha多樣性主要關(guān)注某一個(gè)群落中的物種多樣性，而beta多樣性主要關(guān)注不同群落之間的物種多樣性差別。

6.16S 多樣性測(cè)序引物該怎么選擇？

傳統(tǒng)方法中最常用的引物是27F和1492R，幾乎能擴(kuò)增出完整的16S rRNA基因全長(zhǎng)序列，但是由于二代高通量測(cè)序讀長(zhǎng)的限制，該引物明顯不適用于高通量測(cè)序平臺(tái)。考慮到讀長(zhǎng)的限制，只能對(duì)16S rDNA某一段或某兩段可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序。一般而言，環(huán)境微生物組學(xué)常用的，也是認(rèn)可度比較高的測(cè)序區(qū)域，V3-V4，V4-V5，或者單個(gè)V4區(qū)。