1. 問題： RT-PCR 靈敏度：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有 RT-PCR 產物。

    可能原因：

    1 ） RNA 被降解 ( 如何確定 RNA 是否被講解，詳見前 “ 植物 RNA 的提取 ” 。

    建議解決方法：

    在用來驗證完整性之前先在變性膠上分析 RNA 使用良好的無污染技術分離 RNA ；在將組織從動物體取出后立刻處理在 100 ％甲酰胺中儲存 RNA ；如果使用胎盤 RNase 抑制劑，不要加熱超過 45 ℃ 或 pH 超過 8.0 ，否則抑制劑或釋放所有結合的 RNase 。而且，在 ≥0.8mM DTT 時加入 RNase 抑制劑，一定要存在 DTT 。

    2 ） RNA 中包含逆轉錄抑制劑

    建議解決方法：

    通過乙醇沉淀 RNA 除去抑制劑。用 70 ％（ v/v ）乙醇對 RNA 沉淀進行清洗。可以加入糖元（ 0.25μg 到 0.4μg/μl ）以幫助小量樣品 RNA 的恢復。

    逆轉錄抑制劑包括： SDS ， EDTA ，甘油，焦磷酸鈉， spermidine ，甲酰胺和胍鹽。

    將對照 RNA 同樣品混合，同對照 RNA 反應比較產量以檢驗抑制劑。

    3 ）多糖同 RNA 共沉淀

    建議解決方法：

    使用氯化鋰沉淀 RNA 以除去多糖。 自己的實驗經驗： 一般用乙酸鈉就可以出去多糖，但是要用 70 ％乙醇洗 2-3 次除鹽。

    4 ）用于合成 cDNA 第一鏈合成的引物沒有很好退火建議解決方法：

    確定退火溫度適合您的引物。對于隨機六聚體，建議在反應溫度保溫之前先在 25 ℃ 保溫 10 分鐘。

    對于基因特異性引物（ GSP ），可以試一下其他 GSP ，或換用 oligo(dT) 或隨機六聚體 . 確定 GSP 是反義序列。

    5 ）起始 RNA 量不夠

    建議解決方法：

    增加 RNA 量。

    對于＜ 50ng 的 RNA 樣品，可以在第一鏈 cDNA 合成中使用 0.1μg 到 0.5μg 乙酰 BSA 。

    6 ） RNA 模板二級結構太多

    建議解決方法：

    將 RNA 和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性 / 退火 . 提高逆轉錄反應溫度，對 SuperScript Ⅱ 可以到 50 ℃ ，對 ThermoScript 可以到 65 ℃ 。

    注意：不要在＞ 60 ℃ 時使用 oligo(dT) 引物，選擇一個在反應溫度可以退火的 GSP 。對于＞ 1kb 的 RT-PCR 產物，保持反應溫度 ≤65℃ 。

    注意：不要在高于 37 ℃ 時使用 M-MLV 。

    如果不需要全長 cDNA ，在第一鏈反應中使用隨機引物。

    7 ）引物或模板對殘余的 RNA 模板敏感

    建議解決方法：

    在 PCR 前用 RNaseH 處理。

    8 ）靶序列在分析的組織中不表達

    建議解決方法：

    嘗試其他靶序列或組織

    9 ） PCR 沒有起作用

    建議解決方法：

    對兩步法 RT-PCR ，不要在 PCR 步驟中使用超過 1/5 的逆轉錄反應產物。

    2. 問題： PCR 靈敏度：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有 RT-PCR 產物。

    可能原因：

    1 ） PCR 引物設計較差

    建議解決方法：

    避免在引物 3' 端含有互補序列。避免可以形成內部發卡結構的序列。設計 Tm 類似的引物。

    2 ） DNA 含有抑制劑

    建議解決方法：

    諸如 DMSO ， SDS 和甲酰胺之類的試劑會抑制 Taq DNA 聚合酶。如果懷疑污染了抑制劑，可以使用乙醇沉淀 DNA 。

    3 ）富含 GC 的模板

    建議解決方法：

    對于 GC 含量＞ 50 ％的模板，使用 PCRx Enhancer Solution 。

    4 ）模板濃度太低

    建議解決方法：

    使用 104 拷貝的靶序列，以在 25 到 30 個循環中獲得信號。

    5 ）鎂離子濃度太低

    建議解決方法：

    從 1mM 到 3mM ，間隔 0.5mM 進行一系列反應，確定對于每個模板和引物對的最佳鎂離子濃度。注意：對實時定量 PCR ，使用 3mM 到 5mM 的鎂離子濃度。

    6 ）退火溫度太高

    建議解決方法：

    使用表 4 的公式估算 Tm ，把退火溫度設定為低于 Tm 5℃ 。因為這些公式只是估算 Tm 值，所有真正的退火溫度實際會高些或低些。

    7 ）引物濃度太低

    建議解決方法：

    最佳引物濃度介于 0.1μM 到 0.5μM 之間。為了精確確定引物濃度，在 260nm 測量光密度，然后使用光吸收值和消光系數計算濃度。

    3. 問題： RT-PCR 特異性：在瓊脂糖凝膠分析中觀察到非預期條帶。

    可能原因：

    1 ）物和模板非特異性退火

    建議解決方法：

    在第一鏈合成中使用 GSP ，而不是隨機引物或 oligo(dT) 。

    試用允許高溫 cDNA 合成的 GSP 。

    2 ） GSP 設計較差

    建議解決方法：

    遵循用于擴增引物設計的同樣原則

    3 ） RNA 中沾染了基因組 DNA 建議解決方法：

    使用擴增級 DNase Ⅰ 處理 RNA 。使用沒有逆轉錄的對照反應檢測 DNA 污染。

    4. 問題： PCR 特異性：在瓊脂糖凝膠分析中觀察到非預期條帶。

    可能原因：

    1 ）形成引物二聚體

    建議解決方法：

    設計在 3' 端沒有互補序列的引物。

    2 ）引物和模板非特異性退火

    建議解決方法：

    以 2 ℃ 到 5 ℃ 間隔增加退火溫度，減少退火時間。

    在開始幾個循環使用較高的退火溫度，然后使用較低的退火溫度。

    使用 Platinum Taq DNA 進行自動熱啟動 PCR 。

    避免在引物 3' 端含有 2 到 3 個 dG 或 dC 。

    3 ）鎂離子濃度太高

    建議解決方法：

    對于每一個模板和引物組合優化鎂離子濃度。

    4 ）因為擴增復雜模板導致引物錯誤起始

    建議解決方法：

    使用巢式 PCR 或遞減 PCR 。

    5 ）沾染外源 DNA 建議解決方法：

    使用抗氣霧劑的 tip 和 UDG 。

    6 ）因為二級結構導致引物結合位點無法接近

    建議解決方法：

    對于 GC 含量＞ 50 ％的模板，使用（ 1×-3× ） PCRx Enhancer Solution 。

    5. 問題： PCR 忠實性： PCR 在產物序列中引入了錯誤可能原因：

    1 ）聚合酶忠實性低

    建議解決方法：

    使用帶有校正活性的熱穩定聚合酶，如 Platinum Pfx DNA 聚合酶。

    2 ）循環數太多

    建議解決方法：

    降低循環數。

    3 ）四種 dNTP 的濃度不同

    建議解決方法：

    制備新的 dNTP 混合物，保證四種核苷濃度相同。使用預混合物