哺乳動物細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染能在短期內(nèi)快速表達(dá)高活性蛋白而被廣泛應(yīng)用。本文主要介紹了細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染的步驟、原理，及血球計(jì)數(shù)板對細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法。

哺乳動物細(xì)胞自身具有蛋白折疊和翻譯后修飾的功能，獲得的蛋白更具有天然活性。哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白的方式有兩種：瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)是短期快速表達(dá)，滿足蛋白的小量制備。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染通過構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系能夠滿足蛋白的大量、長期生產(chǎn)。

瞬時轉(zhuǎn)染是指將構(gòu)建好的質(zhì)粒通過某種方式導(dǎo)入到哺乳動物細(xì)胞內(nèi)（主要指 HEK293 細(xì)胞），該質(zhì)粒上的外源基因不整合到細(xì)胞自身的基因組上。隨著細(xì)胞的生長分裂，外源基因會逐漸丟失。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)能夠存在 3-4 天，此時間內(nèi)，質(zhì)粒外源基因在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)錄翻譯，得到極為少量的蛋白。這一整個快速轉(zhuǎn)染得到蛋白的過程就稱為瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)。

細(xì)胞復(fù)蘇

細(xì)胞復(fù)蘇是將保存在液氮或-80℃冰箱中的細(xì)胞株解凍并重新培養(yǎng)的過程。細(xì)胞復(fù)蘇的關(guān)鍵是快速。防止在解凍過程中，產(chǎn)生的水珠形成冰晶損傷細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇一般步驟如下：

1. 預(yù)先加熱水浴鍋，溫度至 37-40℃，并在離心管中準(zhǔn)備好 10mL 培養(yǎng)基

2. 從液氮罐或冰箱中取出細(xì)胞，迅速放進(jìn)預(yù)熱的水浴鍋中，鑷子夾住凍存管晃動，使其受熱均勻

3. 當(dāng)凍存管內(nèi)完全融化時，注意用酒精擦拭凍存管消毒，將液體倒入含有 10mL 培養(yǎng)基的離心管中

4. 離心 5min，去除上清，得到沉淀

5. 用培養(yǎng)基懸浮沉淀，并接種到培養(yǎng)瓶常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇后，生長一段時間，95%的細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞狀態(tài)良好，說明細(xì)胞復(fù)蘇成功。

瞬轉(zhuǎn)步驟

以 Lipofectamine 轉(zhuǎn)染試劑為例的操作流程，不同轉(zhuǎn)染試劑參考說明書

1. 將復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞按照 1-3x105 接種到 6 孔板中，加入 2-4mL 的完全培養(yǎng)基，混勻放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中 37℃過夜

2. 無菌狀態(tài)下配置如下溶液：

a 用 100ul 的無血清培養(yǎng)基稀釋 2ug 的待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒

b 用 100ul 的無血清培養(yǎng)基稀釋 25ul 的 Lipofectamine 轉(zhuǎn)染試劑（血清的存在會影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，因此要使用無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染）

3. 將 ab 溶液混合并搖勻，室溫下放置 30min 左右

4. 細(xì)胞培養(yǎng)至 80%單層左右，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞 2 次，每孔加入 1mL 的無血清培養(yǎng)基，并將混合后的 ab 溶液逐滴加入到每孔，按十字方向輕搖混勻，二氧化碳培養(yǎng)箱中 37℃培養(yǎng) 24 小時

5. 將轉(zhuǎn)染液倒出，換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng) 3-4 天后檢測蛋白表達(dá)量

轉(zhuǎn)染檢測

收集培養(yǎng)的細(xì)胞，采用超聲或酶解的方法破碎細(xì)胞，離心得到上清。轉(zhuǎn)染后的檢測主要包括基因水平和蛋白水平的檢測。針對基因水平，使用普通 PCR 或 RT-PCR 進(jìn)行驗(yàn)證，或可使用先達(dá)基因ERA法進(jìn)行檢測，簡單，快速，準(zhǔn)確。蛋白水平，使用 western blot 檢測。

細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理就是測定單位體積內(nèi)細(xì)胞的數(shù)量從而得到細(xì)胞總濃度，在細(xì)胞培養(yǎng)和測定細(xì)胞生長曲線的過程中廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)是采用血球計(jì)數(shù)板對細(xì)胞計(jì)數(shù)，步驟如下：

1. 將計(jì)數(shù)板的蓋玻片洗凈晾干，并消化細(xì)胞離心加入培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，制得細(xì)胞懸液

2. 稀釋細(xì)胞懸液，按照一定的倍數(shù)

3. 蓋玻片蓋上計(jì)數(shù)板表面，移液器吸取 10ul 左右的細(xì)胞懸液從血球計(jì)數(shù)板的一方慢慢注入到計(jì)數(shù)板上

4. 蓋玻片具有引流的功能，因此只需輕輕打入到板上孔中即可

5. 顯微鏡下觀察細(xì)胞，按照要求計(jì)數(shù)該血球計(jì)數(shù)板上的細(xì)胞個數(shù)，計(jì)數(shù)方式如圖所示



圖 3 血球計(jì)數(shù)室表面



每個血球計(jì)數(shù)板有上下兩個計(jì)數(shù)室（如圖 1）

每個計(jì)數(shù)室分為九大格（如圖 3）

其中最中間的方格分為 25 個中格，每個中格又被分為 16 個小格，因此計(jì)數(shù)室中一共有 400 個小格。每次計(jì)數(shù)時選取圖 3 中紅色部分計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果乘以 5 得到一個計(jì)數(shù)室中總的細(xì)胞個數(shù)