菌種，多是指國家指定的幾個菌種保藏中心的成品菌種，在液氮狀態(tài)下，盛放在安瓿管中。企業(yè)生產(chǎn)按國家要求，必須要國家指定的菌保中心購買菌種，不得采用外來菌種。

一、常用菌種保藏方法

1、菌種保藏原理

根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞基本處于休眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。

低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。選擇保藏方法時，首先應(yīng)考慮方法能否長期地保持菌種原有的特性，同時也應(yīng)兼顧到方法的經(jīng)濟(jì)和簡便。在實(shí)際工作中，往往多種條件同時使用，以提高保藏效果。

2、菌種保藏步驟

①挑選特征典型的純菌菌落；

②確定保藏的合適菌體形態(tài)；

③選擇最適宜的保藏方法；

④定期對保藏菌種進(jìn)行檢查，觀察是否發(fā)生變化，若有變化，須改變保藏方法，保藏期滿應(yīng)及時進(jìn)行移種；

3、瓊脂斜面低溫保存法

（1）方法：

將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按規(guī)定的溫度和時間培養(yǎng)，待充分生長后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長保藏時間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3個月移種一次，繼續(xù)進(jìn)行保藏。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年——一年。有的甚至更長時間。

（2）適用范圍：細(xì)菌、酵母菌、霉菌保藏。

（3）特點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)是——簡便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對大多數(shù)微生物都適用；

缺點(diǎn)是——保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。

（4）注意事項：

保藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。

保藏時，破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動或生霉，如有異常應(yīng)及時處理。

每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號、名稱逐一核對，確證培養(yǎng)基特征和純度無誤后再繼續(xù)保藏。

保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無糖，其他菌類含糖小于2 %為宜，以免產(chǎn)酸過多，影響菌種存活。

銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。

4、液體石蠟保存法

本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發(fā)，從而延長菌種的保藏期：

（1）方法

將菌種接種于斜面或穿刺于0.3~0.5 %瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。取化學(xué)純的液體石蠟裝在試管中，每管10~15mL，加棉塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，取出置37℃溫箱或110~ 170℃烤箱中1 ~ 2h或干燥器內(nèi)除去液體石蠟中的水分。

將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端1㎝為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中保藏。

（2）適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對細(xì)菌保藏效果較差。

（3）特點(diǎn)：本方法簡便易行，是實(shí)驗(yàn)室常用的一種保藏方法，該法主要使菌種與空氣隔絕。

（4）注意事項：

①保藏時，用新鮮培養(yǎng)物接種，應(yīng)檢查純度和特征后，方可進(jìn)行保藏；

②保藏過程中，需經(jīng)常觀察斜面是否干燥，如干燥，需重新移種；

③使用菌種時，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新鮮斜面上培養(yǎng)，待長出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上即可使用；

④將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時，液體石蠟四濺，引起污染；

⑤液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴(yán)格控制，如太多，會影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1cm為宜；

⑥制備無菌液體石蠟時，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成污染。

二、菌種的復(fù)蘇與保存

菌種的復(fù)蘇與保存應(yīng)在專用超凈工作臺或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

1、菌種的復(fù)蘇

把凍干菌種管、滅菌1mL滴管、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支，移入超凈工作臺或生物安全柜。

先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕，再將凍干菌種管外壁用dian酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。

取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1支滅菌滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi)，并將滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接種的營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)瓊脂斜面置35~37℃培養(yǎng)22~24h。

取出培養(yǎng)物，仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)、有無雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落后，轉(zhuǎn)種3代即可應(yīng)用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進(jìn)行平板分離單菌落。

2、菌種的傳代與保存

方法1：菌斜面（保存）

培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。標(biāo)簽上注明菌名及接種日期。

至冰箱取出的菌種斜面，應(yīng)在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。

點(diǎn)燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠進(jìn)火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅30秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過3次。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞，撥開棉塞，將接種環(huán)伸人管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。

堵上棉塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面1支，照上述操作打開棉塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動，使細(xì)菌劃在斜面的表面上。

取出接種棒，在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵上，然后將接種過細(xì)菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。

將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)22~24小時，霉菌管一般置20~25℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7日。取出后放人冰箱保存，一般 3個月轉(zhuǎn)種一次。

方法2：菌斜面-營養(yǎng)肉湯-分離平板-菌斜面

如果菌落形態(tài)不典型可純化，按下列方法傳代（分離菌落）：用接種環(huán)取上述菌管（斜面）菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5mL/支，已滅菌)，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時后，再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液），接種于分離平板，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時，用接種針選典型菌落劃線于營養(yǎng)瓊脂斜面，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時。一般同時接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)基中，其它用做工作菌種。

常用分離平板包括：大腸埃希菌——EMB瓊脂平板；銅綠假單胞菌——溴化十六烷三甲銨瓊脂培養(yǎng)基；金黃色葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基。

3、菌懸液的制備

取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入超凈工作臺或生物安全柜，放置室溫后，用接種環(huán)取菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5mL/支，已滅菌), 將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)18~24小時，取出備用。

一般于冰箱中保存可用7天。

4、對照用菌液制備

取上述培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液1mL，加到9mL，0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1mL加到9mL，0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-2……以此類推，稀釋至含活菌數(shù)在50 ~ 100個。用平板計數(shù)。

此稀釋菌液用于試驗(yàn)后加陽性對照，可在1天內(nèi)使用。

5、菌種保管

菌種保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動時，必須做好交接工作。菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本，包括名稱、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄使用、轉(zhuǎn)移及銷毀情況和原因。各種菌種應(yīng)按規(guī)定時間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無污染和變異，如，發(fā)現(xiàn)污染和變異時，應(yīng)及時更換。購置菌種，應(yīng)有介紹信。全部保存菌種應(yīng)具備清單，并定期向部門負(fù)責(zé)人報告。