說到細(xì)胞，我想大家應(yīng)該都不陌生。我們最初了解細(xì)胞這個(gè)名詞應(yīng)該是在初中高中的生物課本上。我們也都知道，我們的生命體都是由細(xì)胞這個(gè)微小的單位組成（病毒除外）。

作為一個(gè)科研狗，拿到一管細(xì)胞后我們想到更多的是：這是什么細(xì)胞（動(dòng)物的？植物的？）？原代細(xì)胞？還是細(xì)胞系？或者說，這細(xì)胞是貼壁生長(zhǎng)的？還是懸浮生長(zhǎng)的？那么我們今天就來聊聊什么是原代細(xì)胞。

原代細(xì)胞(primary cell)：是指從機(jī)體的組織(如人組織、小鼠組織、大鼠組織和兔組織等)經(jīng)蛋白酶或其它的方法獲得單個(gè)細(xì)胞并在體外進(jìn)行模擬機(jī)體培養(yǎng)的細(xì)胞，稱為原代細(xì)胞。一般認(rèn)為，培養(yǎng)的原代的第1代細(xì)胞和傳代到第10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。

在我們的科學(xué)研究過程中，每個(gè)涉及到細(xì)胞研究的研究者都會(huì)根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求采用不同的細(xì)胞。根據(jù)自己的課題采用原代細(xì)胞或者細(xì)胞系，我們都知道，細(xì)胞系的培養(yǎng)相對(duì)于原代細(xì)胞來說更為的簡(jiǎn)單和易操作，也不會(huì)擔(dān)心細(xì)胞在正常條件下會(huì)發(fā)生分化、衰老等現(xiàn)象從而影響我們實(shí)驗(yàn)的可信性和重復(fù)性。而原代細(xì)胞從獲取到培養(yǎng)整個(gè)過程要考慮的問題則非常多，接下來我們就具體聊聊吧。

一、原代細(xì)胞的獲取

原代細(xì)胞的獲取，就是從活體上將組織分解成單個(gè)細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng)的過程，且整個(gè)過程要求無菌操作。具體要考慮的問題有：組織分解的方式，培養(yǎng)的時(shí)間，換液時(shí)間，細(xì)胞狀態(tài)判斷和凍存。

組織分解方式

將組織分解成單個(gè)細(xì)胞的方式目前主要有兩種：酶消化法和組織塊法（針對(duì)貼壁細(xì)胞）。

【1】酶消化法：所用試劑：膠原酶和胰酶。

膠原酶的選擇：（根據(jù)自己的組織樣本選擇合適的膠原酶是實(shí)驗(yàn)成功的大前提。）

類型

適用組織

膠原酶Ⅰ

上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的分離.

膠原酶Ⅱ

軟骨，肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織細(xì)胞的分離。

膠原酶Ⅲ

消化組織中連接部分使其成為單個(gè)細(xì)胞，用于哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞解離

膠原酶Ⅳ

多種組織。

膠原酶Ⅴ

胰腺小島組織的分離，將結(jié)締組織分離成單個(gè)細(xì)胞。

膠原酶的配制：建議看相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行膠原酶的配制。小編常用的是DMEM進(jìn)行配制，配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱（注意現(xiàn)用現(xiàn)配）。

胰酶（酶聯(lián)合法獲取原代細(xì)胞中會(huì)加入胰酶）

膠原酶消化時(shí)間：根據(jù)組織特性，消化時(shí)間會(huì)有差異。以小鼠腎細(xì)胞為例，加入膠原酶Ⅰ進(jìn)行消化后，放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右，期間每隔10min中震蕩一次，知道組織塊幾乎完全消失為止（若是組織塊剪得非常細(xì)小，時(shí)間可以短一些，30min左右即可）。

培養(yǎng)過程：注意原代細(xì)胞在培養(yǎng)2天后可能會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞液變黃（橘黃色）的現(xiàn)象，且無漂浮物，這是正常現(xiàn)象哦，不是污染。這是由于細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)過程中釋放了CO2和其他物質(zhì)導(dǎo)致培養(yǎng)液PH發(fā)生了改變，所以變黃。

【2】組織塊法

取材：取組織中間部位，剪成大小均勻的小方塊（1~4mm2），清洗干凈后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中各組織塊要排列均勻。

加液：培養(yǎng)液不能浸沒組織塊，避免組織漂浮。然后培養(yǎng)4h左右加培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后換液。

培養(yǎng)時(shí)間

無論是酶消化法還是組織塊法，取樣后培養(yǎng)時(shí)間最少需要一周以上的時(shí)間，期間可換液或者傳代。

換液時(shí)間

無論酶消化法還是組織塊法，在培養(yǎng)期間需要隨時(shí)關(guān)注細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，需觀察其是否貼壁，是否污染，組織塊法要觀察是否有細(xì)胞遷移出來。正常情況下48~72h可換液一次。

細(xì)胞狀態(tài)判斷

正常貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)幾天后，會(huì)逐漸貼滿整個(gè)瓶底或者皿底，有的呈纖維狀，有的呈多邊形。下圖均為比較健康的原代細(xì)胞圖（左：小鼠成纖維細(xì)胞；右：雞胚成纖維細(xì)胞；下：人成纖維細(xì)胞）

這些細(xì)胞的狀態(tài)比較好，生長(zhǎng)至80%~90%融合就可以傳代啦，傳代一次后的細(xì)胞會(huì)更干凈漂亮。

凍存

傳一代后的細(xì)胞（也可以不傳代直接凍存）培養(yǎng)至80%~90%便可凍存起來供后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。

凍存液配制：不同的細(xì)胞可能會(huì)有不同的凍存液配制方案，各實(shí)驗(yàn)室也有自己的凍存方案，常見的方案有：

A: 10%DMSO+90%的FBS

B: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM

C: 5%DMSO+45%DMEM+50%FBS (小編常用小鼠的，鹿的都嘗試過，細(xì)胞狀態(tài)OK)

二、原代細(xì)胞的培養(yǎng)

原代細(xì)胞的培養(yǎng)其實(shí)與細(xì)胞系的培養(yǎng)無多大差別，針對(duì)不同的細(xì)胞會(huì)選擇不同的細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.培養(yǎng)液選擇：（根據(jù)不同的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行培養(yǎng)液的選擇）

最chang用的L/H DMEM，F(xiàn)12 DMEM，RPMI 1640。

2.細(xì)胞培養(yǎng)過程無菌操作。正常的復(fù)蘇，換液和傳代操作，最后將培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)即可

3.細(xì)胞鑒定。有時(shí)候我們獲取的原代細(xì)胞可能會(huì)有不是自己期望的細(xì)胞在里面，或者獲取的不是我們的目標(biāo)細(xì)胞。這個(gè)時(shí)候我們需要進(jìn)行細(xì)胞的鑒定。細(xì)胞鑒定需要購(gòu)買特定細(xì)胞的表面標(biāo)志物抗體或者染色試劑進(jìn)行鑒定。

三、原代細(xì)胞試用的實(shí)驗(yàn)類型

前面我們了解了原代細(xì)胞獲取和培養(yǎng)過程中應(yīng)該注意的一些細(xì)節(jié)，這有助于我們培養(yǎng)我們的原代細(xì)胞。那么原代細(xì)胞培養(yǎng)好后，它可適用哪些研究呢？

原代細(xì)胞不僅廣泛應(yīng)用于分子、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究，如蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、細(xì)胞株（系）研究、DNA，RNA和遺傳學(xué)研究等，還可應(yīng)用于當(dāng)今熱門的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。在這些應(yīng)用中幾乎都涉及了幾個(gè)最常見的且最基礎(chǔ)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如下：

細(xì)胞增殖檢測(cè)：

常見檢測(cè)方法：CCK8檢測(cè)法 ，MTT檢測(cè)法，Brdu檢測(cè)法，Edu檢測(cè)法，平板克隆形成

細(xì)胞周期檢測(cè)

常見檢測(cè)方法：流式檢測(cè)細(xì)胞周期，標(biāo)記有絲分裂百分率法

細(xì)胞凋亡檢測(cè)

常見檢測(cè)方法：流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡，線粒體膜電位，活性氧檢測(cè)，Hoechst染色，電鏡，TUNEL

細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力檢測(cè)

常見檢測(cè)方法：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，Transwell實(shí)驗(yàn)，Invasion實(shí)驗(yàn)