1、免疫熒光技術

免疫熒光技術(immunofluorescence technique)是在生物化學、顯微鏡技術和免疫學基礎上發展起來的一項檢測技術,是用熒光標記的抗體或抗原與被檢樣品中相應的抗原或抗體結合,在顯微鏡下檢測熒光,并對樣品進行分析的方法。它把顯微鏡技術的精確性和免疫學檢測的特異性、敏感性有機地結合在一起。這一方法的特點是特異性強、靈敏度高。根據熒光素標記的方式不同,可分為直標熒光抗體和間標熒光抗體。

①直標免疫熒光技術:該方法是最早的免疫熒光技術,是用已標記了熒光素的特異性熒光抗體直接滴在含有相應抗原的載玻片上進行孵育,在熒光顯微鏡下觀察檢查結果。由于該方法的檢測敏感性低,且每檢查一種抗原都需要制備其特異的熒光抗體,應用并不廣泛。反應式如下:

Ag+Ab-熒光 Ag·Ab-熒光

②間標免疫熒光技術:該方法是應用最廣的免疫熒光技術。是用特異性的抗體與切片抗原結合后,作為第一抗體,再滴加熒光素化的第二抗體,在熒光顯微鏡下觀察結果。通過二抗的結合,能將信號進行放大,因此能在一定程度上提高檢測的靈敏度,但是隨之帶來的高背景也降低了檢測的特異性,因而只需滿足種屬特異性,即可用于多種第一抗體的標記檢測。反應式如下:

Ag+AbAg·Ab+G-熒光Ag·Ab·G-熒光

③時間分辨熒光免疫分析法:該方法是同位素免疫分析技術。是用鑭系元素標記抗原或抗體,根據鑭系元素螯合物的發光特點,測量波長和時間兩個參數進行信號分辨。該法可有效地排除非特異熒光的干擾,極大地提高了分析靈敏度。

④補體法:該方法是間接染色法的一種改良法。是將抗原和抗體及補體三者結合為復合物后,再與熒光素標記的抗補體進行反應,四者形成復合物,在熒光顯微鏡下觀察結果。補體法不但有與間接法相同的優點,而且只需要一種標記抗補體抗體,就可實現各種抗原抗體系統的檢測。該法雖敏感,但參加反應的因素較多,故特異性差。

2、放射免疫檢測技術

放射免疫檢測技術(radioimmunoassay,RIA) 是目前靈敏度最高的檢測技術,利用放射性同位素標記抗原(或抗體),與相應抗體(或抗原)結合后,通過測定抗原-抗體結合物的放射性判斷結果。放射性同位素具有皮克級的靈敏度,且利用反復曝光的方法可對痕量物質進行定量檢測。但放射性同位素對人體的損傷也限制了該方法的使用。

3、酶聯免疫吸附測定技術

酶聯免疫吸附測定技術(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是目前應用最廣泛的免疫檢測方法,是將二抗標記上酶,抗原抗體反應的特異性與酶催化底物的作用結合起來,根據酶作用底物后的顯色顏色變化來判斷試驗結果,其敏感度可達納克級水平。常見用于標記的酶有辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)等。由于酶聯免疫法不需要特殊的儀器,檢測簡單,因此被廣泛應用于疾病檢測。常用的方法有間接法、夾心法以及 BAS-ELISA。

間接法是先將待測的蛋白包被在孔板內,然后依次加入一抗、標記了酶的二抗和底物顯色,通過儀器(例如酶標儀)定量檢測抗原。這種方法操作簡單,但由于高背景而特異性較差,目前已逐漸被夾心法取代。反應式如下:

Ag+Ab-125IAg·Ab-125I(測定其放射性)或Ag-125I+AbAg·125I·Ab

夾心法利用兩種一抗對目標抗原進行捕獲和固定,在確保靈敏度的同時大大提高了反應的特異性。

4、免疫膠體金技術

免疫膠體金技術(immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸(HAuCl₄)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等的作用下,聚合成為特定大小的金顆粒,并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態,稱為膠體金。膠體金在弱堿環境下帶負電荷,可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合,由于這種結合是靜電結合,所以不影響蛋白質的生物特性。膠體金除了與蛋白質結合以外,還可以與許多其他生物大分子結合,如 SPA、PHA、ConA 等。根據膠體金的一些物理性狀,如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應,加上結合物的免疫和生物學特性,因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。此方法簡單,快速,廣泛應用于臨床篩查。