實驗概要

免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。

實驗步驟

1. 將腦片放到，6 孔板（或 12 孔板），按照二抗說明書，加 3%雙氧水封閉 10min（如果是從切片保護液取出，則要用 PBS 洗一遍）；（二抗不同，操作步驟有差別）；

2. 吸去雙氧水，PBS 洗兩遍，將腦片周圍的水用吸水紙或衛生紙擦凈，注意不要碰到腦片；

3. 然后按照一抗說明書，將一抗按比例稀釋，加入稀釋后的一抗，一般，大鼠腦片一張需 50 微升一抗稀釋液，小鼠腦片為 30 微升；注意不要讓液體流到邊上；如果流到邊上，要重新加或者加大量，使腦片完全浸入液體；

4. 然后，4℃，過夜（18h 或者 24h），不建議使用 37℃；

5. 然后，PBS 洗凈兩遍；剩下步驟見二抗試劑盒說明書。

6. DAB 配方為：10mg DAB 固體加到 20ml 0.01MPBS，臨用時加 100-200 微升30%雙氧水，注意避光。

7. 顯色 10min，看片子染色深淺情況適當調整顯色時間。一般 3 分鐘顯色就比較明顯，如果 20 分鐘仍未顯色，則看下面的參考。

8. 然后 PBS 洗兩遍，轉移到載玻片，自然晾干。干燥天氣 2-3h，潮濕天氣 3-4h。

9. 脫水：70%酒精 3min，95%酒精 3min，100%酒精 3min，100%酒精 2min，二甲苯 2min，二甲苯 3-5min。如果片子上鹽分較多，在 70%酒精前在雙蒸水1min。

10. 將腦片放到 6 空板的山羊血清封閉液中，封閉 20-40min；（如果是從切片保護液取出，則要用 PBS 洗一遍）

11. 吸去山羊血清，PBS 洗兩遍，將腦片周圍的水用吸水紙或衛生紙擦凈，注意不要碰到腦片；

12. 然后按照一抗說明書，將一抗按比例稀釋，加入 PBS 稀釋后的一抗，一般，大鼠腦片一張需 50 微升一抗稀釋液，小鼠腦片為 30 微升；注意不要讓液體流到邊上；如果流到邊上，要重新加或者加大量，使腦片完全浸入液體；

13. 4℃，過夜（18h 或者 24h），不建議使用 37℃，如果熒光亮度不強，可以延長孵育時間到 48 或 72 小時；

14. 然后，PBS 洗凈兩——三遍，按照二抗說明書稀釋的熒光二抗，室溫孵育 2小時。注意避光操作。

15. 0.01M PBS 洗兩遍，轉移到載玻片上，避光自然晾干；

16. 滴加防淬滅劑后，蓋上蓋玻片鏡下觀察。

注意事項

1. 熒光太暗：可能蛋白表達少；可能一抗孵育時間短；二抗孵育時間短；清洗次數過多；溶液 pH 不合適；熒光萃滅；一抗濃度過低或過高；二抗濃度過低或過高；激發波長不在抗體適用波段。

2. 背景熒光太深：一抗濃度過高，清洗不徹底；二抗濃度過高，清洗不徹底；封閉時間過短，非特異性過強；一抗非特異性過強；二抗非特異性過強；顯微鏡熒光強度過強。