什么是IF（免疫熒光）染色？

免疫熒光（IF）是一種用于檢測以及識別細胞和組織中蛋白質和其他分子的亞細胞分布和遷移的強大檢測技術。IF可用作免疫組織化學 (IHC) 或免疫細胞化學 (ICC) 中使用的傳統顯色標記的替代物。通過使用多種標記物的二級抗體，可以研究感興趣蛋白的共定位，這是不能通過常規IHC或ICC實現。這是同時分析許多目標蛋白時的一個優勢，可同時生成大量亞細胞定位的準確數據。

什么時候使用IF？

1.IF是一個很好的檢測技術工具，用于研究感興趣的產物如分子、蛋白質或糖蛋白的表達、定位、分布和遷移。

2.用作顯色標記物的替代物，例如3,3 '-二氨基聯苯胺 (DAB) 。

IF與ICC和IHC的區別

IHC和ICC使用的樣本類型不同。IHC利用通常冷凍或石蠟包埋的整個組織樣本。ICC指的是分離的或培養的細胞樣本。這兩種樣本類型都可以使用IF進行標記檢測。直接法IF使用帶有偶聯熒光染料（共軛抗體）的一級抗體。間接法IF需同時使用可結合靶標抗原一抗和偶聯熒光染色的二抗。

優化IF，以下IF實驗優化小技巧可以節省您的時間和成本，從而避免浪費您的寶貴樣品。

1. 設置對照：可以使用陽性和陰性對照來確定結果的準確性，并幫助確定任何問題的來源。

2. 樣品和試劑的存儲：由于IF中所用抗體和實驗樣品的熒光性質，因此必須適當存儲。最好將熒光抗體和經過IF處理的樣品都保存在完全黑暗的環境中。使用琥珀色或鋁箔覆蓋抗體管。

3. 使用適當的固定劑：醛可用于標記膜結合抗原或細胞骨架抗原，并應用于核蛋白或線粒體蛋白。醛固定后的樣本需要抗原修復和打孔滲透步驟才能正確檢測抗原。如果使用單克隆抗體推薦有機溶劑用于組織固定。甲醇適用于冷凍樣本的固定；丙酮固定對組織學保存效果較好。

4. 仔細選擇抗體：應檢查所有抗體，無論是單克隆抗體還是多克隆抗體，以確保與目標抗原具有高的親和力。所用的二抗必須與一抗兼容，比如使用抗小鼠二抗檢測小鼠來源的一抗。

5. 多色染色：最好使用在不同物種中產生的一抗。如果使用間接檢測，請使用已預先吸附在檢測其他蛋白質的一抗和二抗的種屬以及實驗樣品的物種中的二抗。這樣可以最大程度地減少跨物種的反應性和非特異性結合。所有二抗也應在同一物種中產生，以最大程度地減少交叉反應。一旦確定抗體特異性，就可以同時或依次將目標抗原與其抗體孵育，順序孵育往往會產生更好的結果。對于亞細胞靶標的共定位或復染色，請選擇對細胞器標記特異的抗體。

6. 決定直接或間接染色：兩種方法都有優點和缺點，根據實驗需求選擇。使用這兩種方法，都應該確保充足的洗滌以最小化非特異性的結合。

7. 選擇沒有光譜重疊的熒光團：IF是一種很好的多路復用分析技術，測量如此多的參數，那么使用能夠提供可分辨信號的熒光團是很有必要的。