人黏膜地址素細胞黏附分子(MAdCAM-1)使用目的：
本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關液體樣本中黏膜地址素細胞黏附分子(MAdCAM-1)含量。

人黏膜地址素細胞黏附分子(MAdCAM-1)實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人黏膜地址素細胞黏附分子(MAdCAM-1)水平。用純化的人黏膜地址素細胞黏附分子(MAdCAM-1)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入黏膜地址素細胞黏附分子(MAdCAM-1)，再與HRP標記的黏膜地址素細胞黏附分子(MAdCAM-1)抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的黏膜地址素細胞黏附分子(MAdCAM-1)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人黏膜地址素細胞黏附分子(MAdCAM-1)濃度。
 
試劑盒組成：
Reagent    Quantity
酶標包被板    12well×8strips
標準品      1600pg/ml    1×0.5ml
標準品稀釋液    1×1.5ml
酶標試劑    1×6ml
樣品稀釋液    1×6ml
顯色劑A液    1×6ml
顯色劑B液    1×6ml
終止液    1×6ml
30倍濃縮洗滌液    1×20ml×30flod
說明書    1
封板膜    2
密封袋    1

樣本處理及要求：
1.  血清：室溫血液自然凝固  10-20  分鐘，離心  20  分鐘左右（2000-3000  轉/分）  。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。
2.  血漿：應根據標本的要求選擇  EDTA  或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合  10-20  分鐘后，離心 20  分鐘左右（2000-3000  轉/分）  。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3.  尿液：用無菌管收集，離心  20  分鐘左右（2000-3000  轉/分）  。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4.  細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心  20  分鐘左右（2000-3000 轉/分）  。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用  PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到  100  萬/ml  左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心  20  分鐘左右（2000-3000  轉/分）  。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5.  組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的  PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持  2-8℃的溫度。加入一定量的  PBS（PH7.4）  ，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心  20  分鐘左右（2000-3000  轉/分）  。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6.  標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7.  不能檢測含  NaN3  的樣品，因  NaN3  抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟：
1. 標準品：其濃度為1600pg/ml(貯液)。先將其稀釋為1600pg/ml（標準曲線最高濃度)后，再準備5個稀釋標準品的EP 管，每個EP 管中加入150μL 的標準品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋成1600pg/ml，800pg/ml，400pg/ml，200pg/ml，100pg/ml，50pg/ml標準品稀釋液（0pg/ml）直接作為空白孔。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液
Tube    0    1    2    3    4    5
pg/ml    1600pg/ml    800pg/ml    400pg/ml    200pg/ml    100pg/ml    50pg/ml
 2.  加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）  、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液  40μ l，然后再加待測樣品  10μ l（樣品最終稀釋度為  5  倍）   。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3.  溫育：用封板膜封板后置  37℃溫育  30  分鐘。
4.  配液：將  20  倍濃縮洗滌液用蒸餾水  20  倍稀釋后備用。
5.  洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置  30  秒后棄去，如此重復  5  次，拍干。
6.  加酶：每孔加入酶標試劑  50μ l，空白孔除外。
7.  溫育：操作同  3。
8.  洗滌：操作同  5。
9.  顯色：每孔先加入顯色劑  A50μ l，再加入顯色劑  B50μ l，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色 15  分鐘.
10.  終止：每孔加終止液  50μ l，終止反應（此時藍色立轉黃色）  。
11.  測定：以空白空調零，450nm  波長依序測量各孔的吸光度（OD  值）  。 測定應在加終止液后  15  分鐘以內進行。

注意事項：
1． 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡  15-30  分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本  OD
值大于標準品孔第一孔的  OD  值）  ，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n  倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數（×n×5）  。
5．  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．  底物請避光保存。
7．  嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8．  所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9．  本試劑不同批號組分不得混用。

計算：                                        
以標準物的濃度為橫坐標，OD  值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與  OD  值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD  值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數  R  值為  0.990  以上。
2.批內與批見應分別小于  9%和  11%
3.保存條件及有效期：
a.試劑盒保存：2-8℃。
b.有效期：6  個月