人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)ELISA試劑盒

    本試劑僅供研究使用 標(biāo)本：組織勻漿

    試驗原理：

    t-PA試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知t-PA濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將t-PA和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中t-PA活性濃度呈比例關(guān)系。

    試劑盒內(nèi)容及其配制

    試劑盒成份（2-8℃保存）96孔配置48孔配置配制

    96/48份酶標(biāo)板1塊板（96T）半塊板（48T）即用型

    塑料膜板蓋1塊半塊即用型

    標(biāo)準(zhǔn)品：400pg/ml1瓶（0.6ml）1瓶（0.3ml）按說明書進(jìn)行稀稀

    空白對照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）即用型

    標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液1瓶（5ml）1瓶（2.5ml）即用型

    生物素標(biāo)記的抗t-PA抗體1瓶（6ml）1瓶（3.0ml）即用型

    親和鏈酶素-HRP1瓶（10ml）1瓶（5.0ml）即用型

    洗滌緩沖液1瓶（20ml）1瓶（10ml）按說明書進(jìn)行稀釋

    底物A1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型

    底物B1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型

    終止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型

    自備材料

    1． 蒸餾水。

    2． 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。

    3． 振蕩器及磁力攪拌器等。

    安全性

    1． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

    2． 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

    3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

    人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)ELISA試劑盒操作注意事項

    1． 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。

    2． 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

    3． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

    4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

    5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

    6． 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

    7． 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。

    8． 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。

    9． 按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

    人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)ELISA試劑盒樣品收集、處理及保存方法

    1、 血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

    2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

    3、 細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

    4、 保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

    試劑的準(zhǔn)備

    1． 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備，不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行：

    400pg/ml（6號標(biāo)準(zhǔn)品）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

    200pg/ml（5號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

    100pg/ml（4號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

    50pg/ml（3號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

    25pg/ml（2號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

    12.5pg/ml（1號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

    0pg/ml（空白對照）原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

    2． 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

    人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)ELISA試劑盒操作步驟

    1． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

    2． 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。

    3． 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。

    4． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

    5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

    6． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

    7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。

    8． 取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

    9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。

    局限

    6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到精確的結(jié)果。

    試劑盒性能

    1.靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

    2.特異性：不與人其它細(xì)胞因子反應(yīng)。

    3.重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

    結(jié)果判斷 與 分 析

    1、儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

    2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的t-PA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的t-PA含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

    3、檢測值范圍：0-400pg/ml

    4、敏感度：1.0pg/ml