看到了很多做分子細胞的小伙伴分享了經驗心得，今天也想來試著分享一下神經電生理（在此僅指急性腦切片膜片鉗技術）方面的一些小經驗。

 

 

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實踐篇——知其然

 

扎細胞的基本操作步驟：

 

1）配好 ACSF 充氧（tip：氧要飽和！根據實驗對象、目的、課題設計等各種主客觀情況選用合適的方法技術）

 

2）打開各種儀器。基本就是循環灌流系統（簡單地說就是蠕動泵，使腦片記錄槽中氧飽和的人工腦脊液不斷更換，可防止腦片細菌滋生）、顯微觀察系統（tip：Olympus、Zeiss 等guan網可以了解很多相關知識）、記錄采集系統三大模塊。（tip：在記錄槽充滿溶液的時候再打開加熱器，干燒容易把電阻燒壞；先開硬件，再開軟件，否則會報錯！）

 

3）拉制電極。一般記錄細胞的電極阻值為 3～5 MΩ。太細，破膜后容易重新被阻塞，影響記錄狀態。

 

4）從 -20 ℃ 取出人工細胞內液（冰上保存，因為內液里有 ATP，溫度太高會分解），DIY 針管注射器，燒軟稍涼一會兒再拉伸成適合粗細長度。

 

圖 1

 

5）用自制 pipette（玻璃吸管）從自制 chamber（孵育杯）中取出腦片，此時應保證記錄灌流通路的溶液環境不會缺少氧氣。

 

6）用鉑金片背面壓住腦片（tip：保證盡可能固定，否則腦片震動使記錄不穩定），調整 DIC 至能清晰看到立體飽滿的細胞形態（此處插播「何為 DIC」： 中文名——微分紅外干涉相差成像，就是可以用來觀看細胞形態的黑白小電視）主要調節聚光鏡光斑，使光斑集中點落在腦片上。有時一直白茫茫一片，可能是光源太亮而過度曝光，或者是鏡頭與液面之間有氣泡。此時只需調小亮度或是抬起鏡頭重新入水即可。

 

7）用之前 DIY 拉伸好的注射器向微電極中灌注內液，內液應沒過電極中的銀絲，才能與記錄液中的地線連通整個電路，給電極合適正壓。（tip：氣壓太大對腦組織擾動太大，太小腦組織不能被吹開，會阻礙電極接近細胞。）

 

8）用顯微鏡找好目標細胞，然后找電極。（圖 2—6）

 

圖 2. DIC 圖中的電極

 

圖 3.DIC 圖中的腦片表面

 

圖 4. DIC 圖中帶著正壓的電極接近細胞

 

圖 5. DIC 圖中的電極正壓將細胞膜表面吹出小坑

 

圖 6. DIC 圖中釋放正壓的電極與細胞膜形成高阻封接

 

9）電極入水后點擊放大器面板（附圖 7）的 Offset 及測試電壓方波 Seal test。

 

 

10）將微操作器行進速度降低至 3 檔，電極階梯式接近細胞（tip：一定要看到組織適當被吹開，細胞形態變清晰的感覺），從斜正上方壓細胞，發現即將出現（tip：注意時機，迅速把握）氣壓吹出的坑時立即釋放正壓，當示波器波形由剛開始的方波形變成一條直線（即電極與細胞膜之間形成 GΩ高阻封接）時，快速點擊 Holding。

 

11）然后補償快慢膜電容，用負壓破膜，至此連通了電極內液與細胞內液。（tip：破膜過程可以使用 zap 電擊輔助破膜。電容充放電越快，說明破膜情況越好。）

 

12）根據實驗目的給細胞不同電刺激，記錄電信號。（圖 8）

 

 

13）對于腦片出現細菌的小問題，在不做實驗時可用 3% 過氧化氫灌流沖洗整個水路（循環灌流通路）再用雙蒸餾水沖洗，以防過氧化氫影響細胞狀態。

 

 

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理論——知其所以然

 

1）多位前輩代代相傳的入門寶典：

《電生理學方法與儀器入門》，（荷）布雷特奇德著，機械工業出版社（一本深藍色小書）；《實用膜片鉗技術》，劉振偉著，軍事醫學科學出版社（是經典，必備）；

 

2）電生理記錄儀器認知要點：

 

信號放大器——通過二極管對微小的模擬信號進行放大數模轉換器——只認識電壓指令，是放大器的模擬信號與電腦的數字信號之間進行溝通的橋梁信號采集記錄軟件（Spike2，signal 或 pClamp……）

 

 

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其他碎碎念

 

 

如何找到目標腦區？

個人覺得一個不熟悉的腦區，首先通過查圖譜進行了解。靠譜的圖譜可以是 Allen brain institute（圖 9），包括各腦區的基本輪廓（立體、水平切面、矢狀切面、冠狀切面）、基因表達、細胞投射等情況。也可以是相應的大鼠、小鼠腦圖譜外文原版書籍。