我們將著重介紹 Strep-tag^? 在哺乳類細胞表達系統的應用。

 

雖然大腸桿菌 E.coli 表達系統經濟實惠，但由于缺乏重要的脂類，分子螫合物，以及重要的翻譯后修飾，用它表達真核蛋白，可能會影響蛋白本身的折疊及功能，以膜蛋白為例，大腸桿菌表達系統能影響目標蛋白在細胞膜的插入位置、及其應有的功能^[1]。除此之外，當目標蛋白大于 50kDa 時，使用大腸桿菌系統可能表達出不完整的蛋白^[2]。

 

所以，為了研究特定蛋白的功能（如：信號通路）、生產較大型的蛋白，或進行高解析度的結構分析，愈來愈多的實驗組選擇哺乳類表達系統來生產融合蛋白。其原因為哺乳動物細胞生產出的重組蛋白與人類蛋白十分相似，有較完整的蛋白折疊、組合及翻譯后修飾^[3]。因此，愈來愈多科學家們更加關注于—如何從哺乳類細胞中的純化目標蛋白。

 

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親和標簽的選擇

 

首先，需考慮選擇合適的親和標簽。常用于哺乳動物表達系統的親和標簽有 His-tag、FLAG-tag、GST-tag及 Strep-tag^? 等^[4-12]，整理于下表：

 

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這些親和標簽在使用上各有千秋。

 

使用 His-tag 時，常遇到的問題是寄主蛋白與填料的非特異性結合，在哺乳動物重組蛋白的純化過程中，這樣的情況更為明顯。由于系統中有很多含有組氨酸（histidine）的殘基的蛋白，這種蛋白結構與 his-tag 相似，容易與鎳柱結合，因此導致目標蛋白純度降低^[13]。

 

FLAG-tag 系統可在非變性條件下進行純化，能得到高純度、有活性的蛋白，但其缺點為純化介質較為不穩定，且純化成本高上許多^[5]。

 

另一常用的標簽為 GST-tag，一個 26kDa 的蛋白，其特點是表達量高，具高度抗原性，常用來增加目標蛋白的溶解度，但常常會影響目標蛋白的特性，一般推薦純化后將標簽去除^[8]。

 

而 Strep-tag^?（包含 Strep-tag^?II或是 Twin-Strep-tag^?），都是短肽標簽，分別為 8 或 28 個胺基酸，一般不干擾蛋白折疊或活性，因此適合用于蛋白功能性研究^[5]。Strep-tag^? 可以特異性的結合在 Strep-Tactin^? (二代介質) 或 Strep-Tactin^?XT (三代介質) 的生物素的結合位點。洗脫時使用的脫硫生物素（適用于二代）或生物素（三代），對同樣的結合位點有更高的親和力，能將目標蛋白從同樣位置移除，因此得到的目標蛋白純度一般高于 95%^[12]。

 

同時，三代 Strep-Tactin^?XT 與 Strep-tag^? 蛋白的親和力大幅提升，直接加入含目標蛋白的哺乳細胞的培養上清，即可純化出所需蛋白（注: 原本使用二代需先以 Avidin 或是 BioLock 將培養基中的生物素遮蔽，才不會影響純化表現）。

 

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三代 Strep-Tactin^?XT 親和力顯著

 

圖 A 比較了 His-tag 與 Strep-tag^? 直接加入哺乳細胞培養上清的純化目標蛋白的表現。

 

圖 A

 

圖 A：分別向 Strep-Tactin^?XT High Capacity 1ml 重力柱（左）和 Ni-NTA 1ml 重力柱（右）中，同時加入含 4mg mCherry-Twin-Strep-tag (TST) 或 mCherry-His-tag (His) 螢光蛋白的 ExpiCHO 細胞培養上清（注: 接下來的實驗皆是取哺乳細胞表達某抗體后的上清，另加入高純度目標蛋白進行實驗)。由圖可見，Strep-Tactin^?XT（左）能率的捕捉 mCherry-TST，而右方的 mCherry-His 幾乎無法掛柱。

 

此外，我們也測試了其他的蛋白，例如 SEAP (72 kDa) 或抗體 (mAb，其重鏈為 55 kDa)。圖 B 為以 Strep-Tactin^?XT 純化 SEAP-TST、mCherry-TST與 mAb-TST 的 SDS-PAGE 分析結果，可見對于不同蛋白，Strep-tag^? 系統都能純化出高純度的目標蛋白。(注: 紅色標記處為 mCherry 的降解產物，非雜帶)

 

圖 B

 

因 Strep-Tactin^?XT 與 Twin-Strep-tag 蛋白的高親和力，即使目標蛋白的濃度低，使用 Strep-Tactin^?XT 仍可以有效的捕捉上清中的目標蛋白。表 C 整理了幾個實驗的數據，顯示當目標蛋白濃度低于 20 μl/ml 時，得率仍能達到幾近 100%。

 

表 C

 

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Strep-Tactin^?XT 普適性高

 

除了上述實驗所用的 CHO 細胞株外（中國倉鼠卵巢細胞），另一常用于生產蛋白的哺乳動物細胞株為 HEK293(人胚胎腎細胞)，使用上較 CHO 簡單。我們測試了 Strep-Tactin^?XT 的純化表現 : 表 D1 為以 Expi293 表達 SEAP-TST 或 mCherry-TST 蛋白后，目標蛋白的濃度。圖 D2 為純化表現的 SDS-PAGE 分析。從中可知，與 ExpiCHO 培養基相同，直接將表達好的 Expi293 上清加入 1 ml Strep-Tactin^?XT 高載量重力柱中進行純化，一樣能夠快速的得到高純度的目標蛋白。

 

表 D1

 

圖 D2

 

綜上所述，Strep-tag^? 非常適合用在哺乳動物細胞系中表達目標蛋白，其純化過程也與常見的 ExpiCHO 及 Expi293 培養基相容，不須另外處理，讓實驗流程更為便利。加上 Strep-tag^? 系統在純度上的優勢，是目前在這個應用上的選擇。