無蛋白封閉液——WB實驗成功的重要一步
2019-09-23 11:58 作者：洛辰 來源：上海遠慕生物試劑
一提到WB封閉液，人們最先想到的就是脫脂奶粉和BSA，其封閉原理就是利用封閉液中的蛋白成分以吸附的方式結合于膜表面的空白間隙，從而避免一抗的非特異性結合。事實上，除了常規蛋白質配方的封閉液之外，無蛋白-純化學配方的封閉液（BlockPRO TM protein-free Blocking Buffer）也具有很強大的應用前景
作用原理
主要成分為碳氫化合物，包含-CHn、-C6H5，碳氫基團以疏水性作用力結合PVDF膜或NC膜。
與常規蛋白配方封閉液相比具有以下優點：
- 無蛋白配方，杜絕封閉液與蛋白樣品之間的相互作用
- 封閉更有效：小分子結構小，空間位阻小，有利于充分封閉目標蛋白周圍膜空間，又不遮蓋目標蛋白區域
- 高信噪比：提供比傳統封閉緩沖液更好的特定信號和更少的背景噪聲
實驗數據
- 小分子封閉更有效，提升靈敏度，降低背景噪聲
Sample: THP-1 cell lysates ; Blocking time: 1 hour ;Target antigen: pAMPK ; Exposure time: 30 sec
相較于脫脂奶粉、BSA、Casein等蛋白質配方封閉緩沖液，BlockPRO封閉緩沖液具有更好的信號強度
b. 無蛋白配方，不易滋生霉菌，延長抗體使用次數BlockPRO封閉緩沖液為純化學配方，不含蛋白質，稀釋抗體可延長保存時間，抗體重復使用次數增加
應用無蛋白封閉液，以下問題迎刃而解
問題1：使用脫脂奶粉作為磷蛋白檢測的封閉液，為什么檢測不到條帶？？
問題分析及解決辦法：磷蛋白信號本來就不強，脫脂奶粉中含有磷蛋白，產生了更多的非特異性信號；無蛋白封閉液為純化學配方，杜絕封閉液與蛋白樣品之間的相互作用，使用更有效
問題2：使用BSA作為封閉液，為什么有的時候會出現背景太高，特異性信號弱的現象？
問題分析及解決方案：BSA蛋白分子量很大，由于空間位阻可能在目的蛋白鄰近空隙進行過度填充，遮蓋部分目的蛋白信號；無蛋白封閉液主要成分為化學合成的小分子，空間位阻小，有利于充分封閉目標蛋白周圍膜空間，又不遮蓋目標蛋白區域
問題3：用BSA或脫脂奶粉稀釋的抗體，放冰箱，第二次使用的時候發現臭了
問題分析及解決方案：封閉液中含有的蛋白容易滋生霉菌，即使放冰箱也不能長時間保存抗體；無蛋白封閉液中不含易滋生霉菌成分，可延長抗體保存時間
![雙[三(羥甲基)氨基甲烷],CAS:6976-37-0](http://struc.chem960.com/strucimg/7000/ctzw0nzi34oyob9fnlmhiwee.png)
