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要想流式做得好,熒光知識少不了!

2020-06-02 15:45 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
熒光素按激發光波長來分,主要是激發波長為375 nm、405 nm、488 nm和633 nm 4類,其中,常用的是激發波長為488 nm和633 nm的熒光素,如FITC、PE、APC、PI等。

 

{  激發波長為488 nm的熒光素 }


1. 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC):FITC是應用最為廣泛的一種熒光素,經激光激發后發出明亮的黃綠色熒光,最大發射波長為525 nm。FITC的熒光強度受PH影響較大,常隨著PH的降低而減弱,因此,在使用FITC時需格外注意溶液的酸堿度。


2. Alexa Fluor 488:Alexa Fluor是美國分子探針公司開發的系列熒光染料,Alexa Fluor 488的發射光譜與FITC幾乎一致,經激光激發后發出綠色熒光,最大發射波長為519 nm,但其熒光強度和穩定性要優于FITC。一般來說,Alexa Fluor 488在pH 4-10范圍內能保持較好的光穩定性。


3. 藻紅蛋白(phycoerythrin,PE):PE是從紅藻中分離純化獲得的一種常見染料,經激光激發后發出橙黃色熒光,最大發射波長為575 nm。PE具有吸光性能好和光量子產率高的特點,可用于標記表達水平較低的蛋白。在流式細胞術檢測中,PE標記的抗體適用于所有配備488 nm氬離子激光器的流式細胞儀。


4. PE-Cy5:PE-Cy5是一種復合染料,屬于藻紅蛋白偶聯物,在此類復合染料中,激發能量可從PE傳遞到Cy5上,最大發射波長為667 nm。由于PE-Cy5與FITC、PE在光譜上重疊范圍較少,熒光干擾少,因此實驗中常將PE-Cy5與FITC、PE搭配使用。需注意,PE-Cy5不適合與APC搭配使用,兩者熒光重疊大。


5. PE-Cy5.5:PE-Cy5.5也是一種復合染料,能量從PE傳遞到Cy5.5上,最大發射波長為694 nm。同PE-Cy5不一樣,PE-Cy5.5與FITC、PE、APC間熒光干擾小,可搭配使用,且其熒光強度要優于PE-Cy5。


6. PE-Cy7:復合染料,最大發射波長為785 nm。PE-Cy7與FITC無光譜重疊,與APC重疊也較少,因此其可與FITC、PE、APC搭配使用。在實驗中需要注意,PE-Cy7的光淬滅性很強,需要絕對避光環境。


7. PerCP-Cy5.5:復合染料,最大發射波長為695 nm。與PerCP相反,PerCP的光量子產率較低,適用于表達水平較高物質的檢測,PerCP-Cy5.5光量子產率高,可用于表達水平較低物質的檢測。在雙激光管儀器上與APC共同檢測時,需要做補償調節,但比PerCP補償少。


8. PI/7-AAD:碘化丙啶(propidium iodide,PI)和7-AAD(7-amino-actinomycin D)的最大發射波長分別為617 nm和647 nm,是常見的熒光染料,常用于細胞凋亡檢測,可用于鑒別死、活細胞。在大部分流式細胞儀上,PI在FL2或FL3通道檢測,7-AAD在FL3通道檢測。7-AAD同PI 有著相似的熒光特性,但其發射波譜較PI窄,對其他檢測通道的干擾更小,在多色熒光分析中是PI的最佳替代品。

 

{  激發波長為633 nm的熒光素 }


1. 別藻青蛋白(allophycocyanin,APC):APC最大發射波長為660 nm,其標記的抗體適用于所有配備氦氖激光器的流式細胞儀,檢測通道一般是FL4通道。FITC、PE和APC搭配是經典3色搭配。


2. Cy5:Cy5屬于小分子染料,其最大發射波長為670 nm,其標記的抗體適用于所有配備633 nm氬離子激光器的流式細胞儀,檢測通道一般是FL4通道。除流式細胞術外,Cy5同樣適用于傳統的熒光顯微鏡技術。需注意的是,Cy5與單核細胞和粒細胞的非特異性結合多,實驗結果容易出現假陽性。


3. Alexa Fluor 647:Alexa Fluor 647是一種明亮的紅色熒光染料,其最大發射波長為668 nm,一般在流式細胞儀的FL4通道檢測。Alexa Fluor 647具有熒光量子產率高、光穩定性好、適宜的pH范圍廣和不易淬滅等特點,是APC和Cy5的優質替代品。

 

{  常用熒光素及相應檢測通道 }

 
激發光波長 檢測通道 熒光素
488 nm FL1
FITC、Alexa Fluor 488、GFP、Fluo-3
FL2
PE、PI
FL3
PE-Cy5、PE-Cy5.5、PerCP、PerCP-Cy5.5、   PE-Texas Red、7-AAD
FL4
PE-Cy7、PE-Alexa Fluor 750
633 nm FL5
APC、Cy5、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、     Alexa Fluor 700
FL6
APC-Cy7、APC-Alexa Fluor 750
375 nm FL7
Hoechst33342-Blue、DAPI
FL8
Hoechst33342-Red
405 nm FL7
Alexa Fluor 405、Pacific Blue
FL8
Pacific Orange


注:不同型號流式細胞儀的各檢測通道對熒光素的檢測能力是不同的,上表僅為較常見情況,具體檢測通道可檢測熒光素的信息以流式細胞儀配置為準。

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