一些研究表明，目前已經(jīng)公布的基因組存在多種污染，隨著這個(gè)問題越來越突出，我們需要找出方法來應(yīng)對(duì)

Supratim Mukherjee在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)數(shù)以百計(jì)的微生物基因組中會(huì)重復(fù)出現(xiàn)同一種噬菌體序列，這令他感到很驚訝。這位來自勞倫斯伯克利國家實(shí)驗(yàn)室的生物信息學(xué)家最開始是為了比對(duì)這些微生物的代謝途徑，但后來他發(fā)現(xiàn)了幾乎無處不在的序列，“我以為我們發(fā)現(xiàn)了一些新的東西，”他回憶道，“在這些不同的微生物中，這整個(gè)噬菌體基因組是完整地保留下來的。

但當(dāng)Mukherjee一開始分析這個(gè)噬菌體序列時(shí)，他就知道這就是 PhiX 序列，一種Illumina公司測序試劑盒中用做標(biāo)準(zhǔn)品的噬菌體。PhiX 本來是作為一種質(zhì)控檢測指標(biāo)，用于追蹤每個(gè)測序過程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤率的，但在上百個(gè)案例中，Mukherjee發(fā)現(xiàn)研究人員都沒有從其公布的基因組序列中剔除Phi X的序列。
并不是只有Mukherjee一人發(fā)現(xiàn)此種情況，最近大量的報(bào)告表明，發(fā)表的基因組出現(xiàn)污染要不之前想象的多得多。那么這些污染是如何出現(xiàn)的呢？我們有能做些什么，避免這些情況的出現(xiàn)呢？

就此The Scientist雜志請(qǐng)教了幾位研究人員，他們分享了他們的一些Tips，可以檢測和預(yù)防出現(xiàn)“流氓序列”。

廣泛的基因污染

在Mukherjee 研究組意識(shí)到 PhiX 污染可能會(huì)出現(xiàn)了多個(gè)公布的微生物基因組中之后，這一研究組覺得量化其出現(xiàn)頻率。通過分析調(diào)查，Mukherjee等人發(fā)現(xiàn)在已出版的1.8萬個(gè)細(xì)菌和古細(xì)菌基因組（Integrated Microbial Genomes database）中，超過1000個(gè)序列被PhiX 序列污染。今年Mukherjee等人已經(jīng)將這一發(fā)現(xiàn)公布在Standards in Genomic Sciences上。而這些其中的10%也出現(xiàn)在了同行評(píng)審的期刊雜志中。

PhiX 污染還只是冰山一角——現(xiàn)在問題呈指數(shù)級(jí)增長，NCBI總監(jiān)David Lipman說，他也正在篩選過去五年間，呈遞到GenBank中的數(shù)據(jù)。

“我們檢測到2012年細(xì)菌和古細(xì)菌的污染情況還只有2%-3%，” Lipman說，“但之后就急速攀升，到2014年，已經(jīng)接近了10%。今年到目前為止，這一比率達(dá)到23%”。

Sanger研究所的科學(xué)家們也發(fā)現(xiàn)，DNA提取試劑盒、化學(xué)試劑和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的雜菌很容易造成污染，影響微生物組分析的結(jié)果。

研究人員發(fā)現(xiàn)，沒有污染的話對(duì)照樣本應(yīng)該只有一種菌，但有時(shí)卻出現(xiàn)了270種不同的細(xì)菌。與高生物量的樣本相比（糞便樣本），來自血液或肺部的低生物量樣本尤其容易受到污染。

“現(xiàn)在的DNA測序技術(shù)允許人們進(jìn)行深度測序，被廣泛用于稀少微生物群體的分析。我們發(fā)現(xiàn)，這類樣本很容易被其他來源的DNA污染，要么在收集樣品的時(shí)候，要么在DNA提取和擴(kuò)增過程中。污染會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生很大的影響，這一點(diǎn)需要研究者們給予足夠的重視，”Sanger研究所的Alan Walker博士說。

而且微生物也不是唯一出現(xiàn)這么多污染的研究領(lǐng)域，去年倫敦大學(xué)學(xué)院的計(jì)算機(jī)專家William Langdon發(fā)現(xiàn)，千人基因組計(jì)劃中至少7%受到了支原體遺傳物質(zhì)的污染（BioData Mining, 7:3, 2014），因此如果說你對(duì)污染的基因組感到頭疼的話，放心，你不是唯一一個(gè)。

污染從哪里來？

來自圣地亞哥州立大學(xué)的生物信息學(xué)家Rob Edwards說，污染出現(xiàn)的來源很多，“首先就是實(shí)驗(yàn)室成員可能混淆了兩個(gè)樣品，不小心給文件或者樣本貼上了錯(cuò)誤的標(biāo)簽。這些都可以通過加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室管理，提高實(shí)驗(yàn)記錄保存制度等很容易解決。”

另一方面，污染也有可能來自其它本不應(yīng)該出現(xiàn)在樣品中的外來遺傳物質(zhì)，又或者來自培養(yǎng)細(xì)菌周圍的環(huán)境，Edwards說。即使你認(rèn)為自己測序的是單一培養(yǎng)產(chǎn)物，但是在一個(gè)測序循環(huán)中出現(xiàn)多個(gè)物種的情況，并不少見。

此外，如果正在測序來自人類腸道的微生物，那么樣品中自然會(huì)出現(xiàn)人體細(xì)胞，還有即使你只想要測序某個(gè)生物體的細(xì)胞核基因，也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)線粒體和葉綠體基因，這些也都是污染。這些污染當(dāng)然很難完全避免，但是可以采取一些措施：在測序之前清理樣品，或者在測序結(jié)果中剔除污染的序列。

Edwards的研究組聚焦于來自環(huán)境樣品的宏基因組測序，他表示其研究組就常常利用過濾設(shè)備，根據(jù)大小對(duì)病毒和細(xì)菌混合物進(jìn)行分離。如果他們推測樣品中存在人體DNA的污染，那么就會(huì)先剔除這些序列，只留下微生物的基因樣本。

同樣如果需要清除系統(tǒng)中的污染，比如PhiX 對(duì)照序列，目標(biāo)基因序列擴(kuò)增測序用的引物和測序接頭，還有克隆載體等，也可以采用相類似的方法。

考慮完這些，還有一個(gè)容易忽略的問題，那就是設(shè)備機(jī)器在實(shí)驗(yàn)過程中留下的污染，清楚了解這些污染的來源，可以幫助研究人員在測序后選擇方法剔除他們，Edwards說，如果污染重復(fù)出現(xiàn)，那么也許就需要改變方法或調(diào)試機(jī)器了。

然而污染的另一個(gè)來源是臟之間實(shí)驗(yàn)，出血，通過讓基因由事先測序運(yùn)行出現(xiàn)在下一次的機(jī)器。愛德華茲說，只被察覺這種污染可能存在于你的實(shí)驗(yàn)可以幫助您選擇將其刪除后測序的方法。或者，如果它反復(fù)出現(xiàn)，您可以嘗試geng改協(xié)議或故障排除您的機(jī)器。

如何檢測？

毫無疑問，在實(shí)驗(yàn)過程中越早剔除污染物越好，“這些污染會(huì)增加實(shí)驗(yàn)直接的成本，”來自愛丁堡大學(xué)的Dominik Laetsch 說，出現(xiàn)污染，“每分錢理論上你得到的核苷酸信息就越少，”因?yàn)樾枰〞r(shí)間處理和分析不需要的序列。但也有個(gè)好消息——即使序列中充滿了 PhiX、引物、載體和不想要物種的基因，還是能在別人看到你最終公布的基因組之前剔除它們。

Laetsch就開發(fā)了這樣的一個(gè)工具，幫助數(shù)據(jù)分析之前進(jìn)行序列清除，這個(gè)工具叫Blobtools-light，是目前的最新版本，能將你的contigs（組裝成最終序列中的測序DNA重疊部分）與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，然后軟件還會(huì)通過可視化方式來解釋這種比對(duì)——來自相似生物物種的序列會(huì)突出來。

“我們利用這作為初步篩選工具，”Laetsch說，她正在進(jìn)行病原細(xì)菌的相關(guān)研究。

此外，還有一個(gè)類似的程序：ProDeGe (Protocol for fully automated Decontamination of Genomes，全自動(dòng)凈化基因組協(xié)議)(ISME, doi:10.1038/ismej.2015.100, 2015).

與Blobtools一樣，ProDeGe采用的也是公共數(shù)據(jù)庫，可以檢測一個(gè)基因組中的污染，然后將contigs分組歸類到“無污染”組和“污染”組。比價(jià)而言，Blobtools-light可以提供可視化序列圖表，ProDeGe則能幫助研究人員識(shí)別并鑒定污染物是什么。

“這種方法比較簡單，不用了解太多”，Mukherjee說，“因此對(duì)于不擅長此類工具的研究人員來說比較合適。”

當(dāng)然還有其它方法，如NCBI的VecScreen，這是一種可以快速識(shí)別序列中污染載體的方法，晚些時(shí)候NCBI網(wǎng)站還將公布geng多geng先進(jìn)的工具。

不過所有用來檢測污染物的工具都必須把握住特異性和敏感度之間的平衡，也就是精確識(shí)別出污染物，而不刪除靶標(biāo)序列。因此了解清楚你的整體數(shù)據(jù)就顯得額外重要，比如說，如果你分析的是新的基因組，那么程序肯定會(huì)提示了污染物水平高，因?yàn)橐延袛?shù)據(jù)庫并未包含你的序列數(shù)據(jù)。

又或者，如果你知道會(huì)出現(xiàn)高污染細(xì)菌基因組，那么就能列出污染物清單，Edwards說，“我推薦多運(yùn)行幾個(gè)工具，比對(duì)結(jié)果。”

如何去除污染

一旦找到了污染物和污染源，那么就可以開始進(jìn)行數(shù)據(jù)清理了。這其中有多種工具可以選擇，如Edwards研究組開發(fā)的DeconSeq，與其它自動(dòng)化污染篩選程序不同，DeconSeq需要用戶輸入污染物的物種屬性，然后再自動(dòng)剔除基因組組裝內(nèi)容里的屬于這一物種的序列。

如果跳過了這一步驟，也許就會(huì)引起麻煩。Lipman研究組在NCBI系統(tǒng)中就運(yùn)行一個(gè)針對(duì)每個(gè)呈遞到GenBank中序列的外源污染物篩選，他希望當(dāng)篩選出一個(gè)序列標(biāo)記為污染物時(shí)，科學(xué)家們能將其認(rèn)為是了解數(shù)據(jù)的一個(gè)機(jī)會(huì)，并且了解技術(shù)的弱點(diǎn)，在未來避免出現(xiàn)這個(gè)問題。

“如果你只是說‘好吧，我的呈遞出現(xiàn)了問題，我現(xiàn)在就修改它’，那么這個(gè)問題還是不斷出現(xiàn)，”Lipman說。

但是如果是在論文公布后發(fā)現(xiàn)基因組中出現(xiàn)污染呢？比如說之后進(jìn)行g(shù)eng多實(shí)驗(yàn)的時(shí)候發(fā)現(xiàn)了錯(cuò)誤，那么重點(diǎn)是盡早修改錯(cuò)誤，以防其他人將這些錯(cuò)誤的成果用于自己的研究中。在某些情況下，這也許就意味著與雜志取得聯(lián)系，看看能不能進(jìn)行勘誤。

“大家需要對(duì)自己的序列數(shù)據(jù)負(fù)責(zé)，”Mukherjee說，“如果你發(fā)現(xiàn)了問題，那么就要撤回它進(jìn)行修改，然后再重新發(fā)布。”

如何改善基因組污染問題

隨著測序技術(shù)的進(jìn)步，也許未來許多污染源會(huì)自動(dòng)消失，這確實(shí)可能，Laetsch說，“隨著組裝過程越來越容易，讀長越來越長，肯定要找出污染也會(huì)變得容易，”但是研究人員不能將這作為停止篩選污染物的借口，“你放入的樣品越好，測序機(jī)器就會(huì)做的越好。”

而隨著基因組數(shù)據(jù)變得越來越龐大，要想獲得干凈的序列也越來越難，這有賴于每個(gè)學(xué)者都盡其所能確保自己基因組序列不出現(xiàn)污染，“我認(rèn)為科學(xué)界都知道污染物是個(gè)大問題，但是這還需要geng多的努力”，Mukherjee說。

GenBank中污染物出現(xiàn)頻率猛增，Lipman也贊同這個(gè)問題的共識(shí)性，為何會(huì)出現(xiàn)越來越的污染呢，Lipman對(duì)這個(gè)問題表示，“越來越多的實(shí)驗(yàn)室都可以進(jìn)行測序研究了，這本身是個(gè)令人高興的事情。”